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目的1.以CD34、CD133双抗体标记阳性作为内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell,EPC)的标志,探讨研究大鼠外周血内皮祖细胞的分离和标记方法;2.利用大脑中动脉线栓闭塞法(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血(Focal cerebral ischemic,FCI)模型;3.通过使用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)结合CD34、CD133双抗体标记技术,检测急性脑缺血老年大鼠外周血中EPC随时间变化的趋势和特点,探讨EPC在急性缺血性脑血管病过程中的病理生理意义,为今后研究有效的干预措施提供理论依据。方法1.使用健康老年Wistar雄性大鼠50只(550±50g,18月龄),采用随机数字表法将其分为永久性缺血组(n=20)、缺血-再灌注组(n=20)、假手术组(n=10),应用改良的Zea-Longe大脑中动脉线栓闭塞法建立老年大鼠永久性脑缺血和缺血-再灌注模型。2.大鼠清醒状态下,使用直径1mm的毛细采血管取大鼠内眦球后静脉丛血,分别对各组中每只大鼠手术前24h(即0h),手术后3h、24h、3d、5d、7d、10d进行连续采血,每次采血1ml。其中在手术后24h,从永久缺血组和缺血再灌注组中各随机抽取6只大鼠,将其处死取脑并行TTC染色及病理学检查;剩余大鼠按时间点取血行流式细胞术检测。各组中存活至10d的大鼠,按照随机原则,各设10个实验样本,对其实验数据进行统计学分析。3.采用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠外周血中单个核细胞;4.使用CD34、CD133双抗体标记结合流式细胞术检测老年大鼠外周血中的EPC,对各组手术前后各时间点(手术前24h、手术后3h、24h、3d、5d、7d、10d)CD34、CD133双阳性细胞进行计数,分析其变化趋势和特点。结果:1.经流式细胞术检测,大鼠外周循环血中CD34、CD133双抗体标记阳性的细胞为EPC;2.永久缺血组和缺血-再灌注组的EPC水平在手术后3h较正常均无明显变化(P＞0.05),此后EPC水平逐渐下降,至24h降至最低(P＜0.01),其中以永久缺血组降低最为显著(P＜0.01)。永久缺血组和缺血-再灌注组的EPC水平在手术后3d开始逐渐回升。3.缺血-再灌注组EPC水平在手术后5d呈现明显上升趋势(P＜0.01),缺血后7d时已接近正常水平(P＞0.05);永久缺血组在缺血后7d时EPC水平仍低于正常水平(P＜0.01),在手术后10d时方达到正常范围(P＞0.05)。结论:1.大鼠外周循环血中存在表达CD34/CD133双表型阳性的EPC;2.以CD34、CD133作为EPC的表面特征性标志,使用CD34、CD133双抗体标记结合流式细胞仪检测、计数外周血中EPC数目的方法简便可行;3.MCAO法建立大鼠局灶性脑缺血模型,操作简便,闭塞效果好,对动物损伤小,不影响缺血后脑组织病理生理学变化的自然过程,是一种比较成熟的动物缺血模型的制备方法。4.急性脑缺血大鼠大脑中动脉闭塞后24h EPC水平显著降低,随着时间的延长可逐渐恢复到正常水平;5.永久缺血组EPC水平降低程度较缺血-再灌组显著,且持续时间长,表明EPC水平可能与缺血程度相关。