沙门氏菌属是一群寄生于人和动物肠道内的无芽胞直杆菌,绝大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性,能引起人和动物的多种不同临床表现的沙门氏菌病,且为人类食物中毒的主要病原之一,在医学、兽医和公共卫生上均十分重要。肠炎沙门氏菌属于沙门氏菌属,它主要引起畜禽的胃肠炎、人类肠炎和食物中毒,其中对家禽的感染主要发生于肉鸡、蛋鸡中。如今,肠炎沙门氏菌引起的病例比例不断上升,严重影响了养禽业的发展,并且威胁着人类的健康,引起了公共卫生很大的关注。随着对细菌sRNA研究的深入及生物信息学技术的逐渐成熟,在沙门氏菌中大约发现70种沙门菌sRNA.这些sRNA能够识别温度、渗透压、pH值等环境的信号,与mRNA或者特定的蛋白质结合,调节细菌的翻译过程及蛋白质的活性。micC是存在于沙门氏菌中的一种sRNA基因,它能够在分子伴侣Hfq蛋白的辅助下阻止核糖体与外膜蛋白r1RNA的结合,进而对外膜蛋白的翻译过程起到调控作用。本文将从以下几个方面对sRNAmicC基因的功能进行探索性的研究。1肠炎沙门氏菌sRNAmicC缺失株及其回补株的构建本实验根据鼠伤寒沙门氏菌micC基因序列设计引物,PCR克隆了肠炎沙门氏菌50336micC基因,通过Red同源重组系统对肠炎沙门氏菌micC基因进行敲除,构建出肠炎沙门氏菌50336△micC缺失株。并通过重组子的构建,成功构建出回补株50336△micC::micC,体外重组表达micC基因,为micC基因功能的研究提供了有价值的素材。构建程序为：以质粒pKD3为模板,PCR扩增出含氯霉素抗性、具有和(?)micC基因上下游序列同源的融合PCR片段,转化入含重组质粒pKD46的肠炎沙门氏菌标准株50336中,融合PCR片段在pKD46表达的重组酶的作用下,氯霉素抗性基因与micC基因发生同源重组,抗性基因cat替换靶基因micC,氯霉素抗性的平板筛选出阳性克隆50336△micC::cat,进一步利用pCP20编码的Flp重组酶进行第二次重组,消除氯霉素抗性基因,获得肠炎沙门氏菌基因缺失株50336△micC。(?)将构建的缺失株50336△micC进行PCR扩增和测序检测,证实缺失株构建正确。以标准株50336为模板,PCR扩增micC基因,利用micC基因序列两端引入的NheI和SaiI酶切位点,将micC基因克隆到表达载体pBR322中构建重组表达载体,并将其转化入突变株50336△micC,成功构建回补株。Red同源重组系统对于一次重组的PCR产物及感受态细胞要求很高,重组率比较低,但二次重组的效率很高,利用此系统成功构建的缺失株50336△micC以及回补株50336△micC::micC为进一步研究sRNA micC基因的功能奠定了基础。2肠炎沙门氏菌外膜蛋白OmpD的生物活性表达及多抗血清的制备本实验利用原核表达系统成功表达出可溶性的肠炎沙门氏菌外膜蛋白OmpD,制备了抗外膜蛋白OmpD的多抗血清。制备程序为：据肠炎沙门氏菌外膜蛋白OmpD基因序列设计一对引物,通过PCR技术从国内标准株50336中扩增ompD基因,并按预定的阅读框插入表达性载体pColdTMF中,获得重组质粒pColdTMTF-ompD,经限制性内切酶酶切消化后琼脂糖凝胶电泳分析及序列测定的结果表明,该序列大小为1089bp,与已发表的ompD结构编码序列完全一致。重组质粒pColdTMTF-ompD转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)并能高效诱导表达,通过SDS-PAGE分析鉴定菌体裂解上清液,该重组菌可以表达大小为82kD的可溶性重组蛋白OmpD-TF。纯化OmpD-TF免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法鉴定多抗血清效价为2.6×105,抗外膜蛋白OmpD多抗血清的制备为进一步研究micC基因对于外膜蛋白OmpD的调控机制提供了有利的工具。3肠炎沙门氏菌sRNA micC功能探索分析本实验利用荧光定量PCR和Western-blotting技术,检测了sRNA micC基因对肠炎沙(?)氏菌外膜蛋白OmpD表达量的影响,以腹腔注射为感染途径,测定了标准株50336、缺失株50336△micC、回补株50336△micC::micC对6周龄Balb/c小鼠的半数致死量(LD50),从而对sRNA micC基因的功能进行探索。荧光定量PCR结果分析,与野生株相比,缺失株及回补株外膜蛋白OmpD的表达量没有显著变化,这一结果可能由于micC基因调控的是翻译过程,而不是转录过程；Western-blotting结果表明micC基因缺失株在24℃过夜培养的条件下,外膜蛋白OmpD的表达量最高,而标准株及回补株在相同条件培养下OmpD的表达量相对较低。LD50测定结果显示,标准株50336、缺失株50336△micC以及回补株50336△micC::micC对6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为12.59cfu、5.01cfu、19.95cfu,说明sRNA micC基因影响了肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的毒力,缺失株50336△micC增强了肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的毒力,而回补株50336△micC::micC则降低了肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的毒力,这可能由于micC基因的缺失及回补,使得肠炎沙门氏菌外膜蛋白OmpD的表达量相应减少和增加,OmpD表达量的变化不仅影响细菌对营养物质和小分子物质的通透性,还相应减弱和增强肠炎沙门氏菌的粘附能力,最终影响毒力。细菌分离鉴定的结果证实,在死亡小鼠的肝、肾、脾、肺、小肠等脏器中都成功分离出攻毒菌株,这些实验结果对micC基因的功能及致病机理的探索提供了科学数据。