激活蛋白-1与甲减大鼠肾脏损伤的相关性研究

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目的:甲状腺功能减退(以下简称甲减)可造成一系列靶组织及靶器官的损害,其对于肾脏结构和功能的损害已被大量临床及动物试验所证实。为研究甲减肾损伤的可能发病机制,本实验观察:制备不同水平的甲减动物模型,通过对大鼠甲状腺功能的测定确定模型复制成功;应用免疫组织化学方法检测激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)亚单位c-Jun、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在甲减大鼠肾脏中的表达,并对其进行半定量分析;应用RT-PCR检测c-Jun在大鼠肾脏组织的基因表达水平。初步研究甲减大鼠肾脏组织中AP-1、TGF-β1与肾脏损伤的关系,探讨AP-1在甲减肾损伤发病中的作用及机制,为临床预防和治疗甲减肾损伤提供理论依据。方法:将Wistar大鼠随机分为轻度甲减组(GHG)、重度甲减组(DHG)和正常对照组(CL),喂养12周后处死,分别检测血清总T3(TT3)、总T4(TT4)、游离T3(FT3)、游离T4(FT4)水平。并利用免疫组织化学、RT-PCR方法,系统分析了不同甲减水平大鼠肾脏组织中c-Jun及TGF-β1的表达差异,并分析两基因与肾脏损伤之间的关系。本研究共分五部分:1实验性大鼠分组及动物模型的制备:选择4-5周龄(70 -100 g)Wistar大鼠,随机分为轻度甲减组(gentle hypothyroid group,GHG)、重度甲减组(dense hypothyroid group,DHG)和正常对照组(control,CL),每组10只,适应喂养1周,条件饲养11周,雌雄各半。饲料实测含碘量为50μg/kg,天津自来水实测含碘量8μg/L,每升饮水中加入KI量: DHG: 0μg, GHG: 163.8μg,CL: 381.7μg,按大鼠每日进食20 g,进水30 ml来估计每日总碘摄入量。2血清学测定:分别留取三组动物的不抗凝全血4 ml,离心,吸取血清约2 ml,利用化学发光免疫分析方法测定血清TT3、TT4、FT3、FT4的水平。3甲减大鼠肾脏形态学改变:以模型为基础,对三组大鼠肾脏组织切片,HE染色,在光镜下观察其形态学变化。4免疫组化:对三组大鼠肾脏切片,进行免疫组化染色。观察核转录因子AP-1亚单位c-Jun和转化生长因子TGF-β1在各组大鼠肾脏组织的表达,分析不同甲状腺激素降低水平对c-Jun和TGF-β1表达的影响,及c-Jun、TGF-β1与肾脏损伤的关系。5甲减大鼠肾脏c-Jun的基因表达:取-80℃保存的新鲜肾脏组织,利用Trizol一步法提取总RNA,再逆转成cDNA,应用RT-PCR的方法扩增目的基因c-Jun,β-actin作为内参照,1.2%琼脂糖凝胶电泳后应用MIAS-2000凝胶成像系统进行灰度测量,结果取目的基因与内参照的比值进行半定量分析。结果:1重度甲减组与正常对照组相比TT3、TT4、FT3、FT4均明显下降(P<0.01)。重度甲减组与轻度甲减组相比TT3、TT4、FT3、FT4均明显下降(P<0.01)。轻度甲减组组与正常对照组相比TT4、FT4明显下降(P<0.01),TT3、FT3稍有降低(P>0.05),无显著性意义。2在光镜下观察HE染色切片,与正常对照组相比,轻度甲减组肾小球、肾小管基底膜增厚,肾小球系膜基质增多、系膜区扩大,肾小球面积减小。重度甲减组比轻度甲减组变化更加明显。3正常对照组肾组织可少量表达c-Jun,肾小球内的表达高于肾小管。c-Jun在肾小球中的表达:重度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.01);重度甲减组与轻度甲减组相比显著增高(P<0.01);轻度甲减组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。c-Jun在肾小管中的表达:重度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.01);重度甲减组与轻度甲减组相比显著增高(P<0.05);轻度甲减组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。正常对照组肾组织中可见TGF-β1的少量表达,在肾小球及肾小管中的表达无明显差异。TGF-β1在肾小球中的表达:重度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.01);重度甲减组与轻度甲减组相比显著增高(P<0.01);轻度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.05)。TGF-β1在肾小管中的表达:重度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.01);重度甲减组与轻度甲减组相比显著增高(P<0.05);轻度甲减组与正常对照组相比显著增高(P<0.05)。4重度甲减组与正常对照组相比,肾脏组织中的c-Jun基因表达水平明显上升(P<0.01)。重度甲减组与轻度甲减组相比,肾脏组织中的c-Jun基因表达水平明显上升(P<0.01)。轻度甲减组与正常对照组相比,肾脏组织中的c-Jun基因表达水平无明显差异(P>0.05)。上述与组织水平上相似的结果进一步在分子水平上证实了c-Jun在甲减肾损伤的发生发展过程中起到了重要作用。结论:1碘不足导致Wistar大鼠甲状腺功能减低,有剂量依赖关系。2甲减可致肾小球、肾小管基底膜增厚,肾小球系膜基质增多、系膜区扩大,肾小球面积减小。病变随甲减加重而加重。3甲减大鼠肾脏组织中c-Jun与TGF-β1表达增高,与甲状腺激素水平有相关性。甲状腺激素水平越低,c-Jun与TGF-β1表达越高。c-Jun在三组大鼠肾小球中的表达均高于肾小管。TGF-β1在正常和轻度甲减大鼠肾小球和肾小管中的表达无明显差异,在重度甲减大鼠肾小球中的表达明显高于肾小管。提示甲减肾损伤主要病变在肾小球。4甲减大鼠肾脏c-Jun mRNA表达上升,随甲减程度加重而增强。5甲减可能通过某种机制激活AP-1,引起TGF-β1等一系列细胞因子和肾脏固有细胞的活化,导致肾脏损伤。
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