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研究背景支气管哮喘(简称哮喘)是多种细胞成分和细胞组分参与的持续的慢性气道炎症性疾病。气道屏障的破坏和高通透性是哮喘发病的启动环节。既往研究表明屋尘螨(HDM)能增加气道上皮屏障的通透性,从而参与哮喘的发生发展。然而,其具体机制尚不明确。热休克蛋白(Hsp)90α通过分泌到细胞外的微环境(简称胞外)而发挥其促细胞动力作用,目前的研究主要集中在伤口的愈合和肿瘤的转移。RhoA信号是生物体内重要的信号,参与了血管内皮及肠道的屏障的破坏,抑制Hsp90可通过破坏src调节的RhoA信号保护内毒素(LPS)诱导的肺内皮细胞的屏障破坏。因此,胞外的Hsp90α(eHsp90α)可能在HDM诱导的气道上皮屏障破坏中扮演十分重要的作用,同样,体外研究也进一步表明了抑制表皮生长因子受体信号(EGFR信号)可明显改善HDM所导致的气道上皮高通透性,但其具体机制尚不明确。实验目的:1、探讨HDM诱导的气道上皮屏障破坏的具体机制和eHsp90α通过激活RhoA/肌球蛋白轻链(MLC)介导HDM诱导的支气管上皮屏障的破坏。2、探讨HDM对肌动蛋白应力纤维(F-actin)重新排布的影响及EGFR信号在其中的作用。实验方法:通过测量跨膜电阻值(TEER)和右旋糖苷的通透率(FITC-DX)来评估HDM诱导的人支气管气道上皮细胞16HBE14o-(16HBE)的屏障功能的破坏,通过免疫蛋白印记法(Western blotting)和免疫荧光(Cofocal)来评估粘附连接蛋白E-cadherin及β-catenin的表达和分布的情况。通过浓缩和纯化条件培养基检测气道上皮细胞对eHsp90α的分泌情况。RhoA的活性是通过Rho G-LISA(?)RhoA activation assay kitTM biochem kit试剂盒测定,通过蛋白免疫印记法测定MLC磷酸化水平。另外,应用Western blotting方法检测HDM对EGFR、磷酸化EGFR及F-actin蛋白水平变化,应用免疫荧光技术观察F-actin的分布变化。实验结果:与对照组相比,HDM刺激16HBE细胞引起上皮细胞单层的高通透性,表现为TEER值下降和FITC-DX升高,且均在400U/ml的HDM最明显。同时,HDM亦可引起粘附连接蛋白E-cadherin和β-catenin的在细胞膜上面的分布异常,由细胞膜向胞浆弥散。另外,HDM刺激16HBE细胞时,可以观察到eHsp90α的分泌是明显增多,且均在400 U/ml的HDM最明显。进一步通过慢病毒下调Hsp90α及预处理eHsp90α的单克隆抗体1G6-D7可以保护HDM诱导的屏障的破坏,表现为TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布异常的改善。同时,400 U/ml的HDM作用16HBE细胞在6h引起RhoA的活性的增加,而同浓度的HDM可引起MLC的磷酸化水平开始6h升高,24 h达最高。然而发现下调Hsp90α及预处理eHsp90α的单克隆抗体1G6-D7可以保护HDM诱导的RhoA的活性和MLC的磷酸化水平。进一步使用Rho激酶的抑制剂GSK429286A和Y27632 2HC1预处理16HBE细胞可以保护HDM诱导的支气管上皮屏障的破坏,表现为TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布异常的改善。另外,人重组(hr)Hsp90α而不是hrHsp90β刺激16HBE细胞亦可以诱导支气管上皮屏障的高通透性及RhoA/MLC信号的活化。然后,予EGFR抑制剂AG-1478进行预处理,实验分为四组:对照组,AG-1478组,HDM组,AG-1478+HDM组。与对照组比较,HDM组磷酸化EGFR表达明显增多,加入EGFR抑制剂AG-1478后E-cadherin和β-catenin的分布异常及TEER值、FITC-DX通透率均明显改善。HDM刺激后促进F-actin表达增多并出现重新排布,而EGFR抑制剂AG-1478可明显抑制这一过程。实验结论:1、研究证明了 eHsp90α通过激活RhoA/MLC信号参与HDM导致的支气管上皮屏障的破坏,提示eHsp90α是哮喘管理治疗的新靶点。2、EGFR信号通过调节F-actin的重新排布促进HDM所导致的气道上皮屏障破坏。