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细胞坏死(necrosis)是一类由化学,物理或生物因素伤害引起的细胞死亡现象,一直被认为是损伤或病变组织产生的不受基因调控的被动的死亡形式。近年发现,某些细胞坏死也严格受到内部分子的调控,如受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和3(RIPK3)调节的细胞死亡拥有普通细胞坏死的表型,这种细胞程序性死亡方式被命名为Necroptosis。Necroptosis分子机制与凋亡(apoptosis)存在显著差异,当凋亡关键酶Caspase的活性被抑制时,可以显著增强Necroptosis诱导剂引发的细胞Necroptosis,因此,诱导肿瘤细胞尤其是对普通诱导凋亡药物产生抗性的细胞发生Necroptosis也被认为是一种潜在的治疗肿瘤的方法。本论文采用缓冲液提取,硫酸铵沉淀,阳离子交换层析以及分子排阻层析得到了一种可以显著抑制肿瘤细胞增殖的蛋白。经MALDI-TOF/TOF-MS和紫外光谱扫描发现,该蛋白为一种含有血红素辅基的分泌型阳离子过氧化物酶,命名为PmPOD(proso millet peroxidase,PmPOD)。为了进一步明确PmPOD诱导肿瘤细胞死亡的机制,本实验以结直肠癌细胞HT29和HCT116为细胞模型,对PmPOD诱导其死亡机制及影响因素展开深入研究。采用MTT法及ATP含量测定法进行细胞活力检测,结合凋亡抑制剂z-VAD-fmk和Necroptosis特异的抑制剂Nec-1,初步确定了PmPOD诱导结直肠癌细胞死亡的方式;Hoechst 33342和PI双染色,以及乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定PmPOD对细胞膜的损伤效应;通过激光共聚焦显微镜观察转染pCMV-RIPK3-GFP和pCMV-MLKL-DsRed2质粒后,RIPK3-GFP和MLKL-DsRed2在细胞内定位的变化;ELISA试验及qRT-PCR技术分析PmPOD诱导的关键信号因子TNF-α的分泌以及Necroptosis关键分子的表达变化;采用甲基化特异性PCR及Western Blot等检测了PmPOD对RIPK3启动子区域甲基化的影响以及RIPK3的表达量对PmPOD诱导的Necroptosis的影响;检测了PmPOD诱导HT29和HCT116细胞Necroptosis时ROS及相关抗氧化酶的变化,以及RIPK1,RIPK3对ROS的产生和坏死的影响。结果显示,PmPOD诱导的结直肠癌细胞HCT116和HT29死亡的机制不是凋亡而是Necroptosis,凋亡抑制剂z-VAD可以显著增强PmPOD诱导的细胞死亡,而坏死抑制剂Nec-1可以明显抑制PmPOD诱导的细胞死亡,这种死亡方式是受RIPK1和RIPK3调控,由MLKL执行的Necroptosis;RIPK3-GFP和MLKL-DsRed在PmPOD作用后由胞质转移到质膜,导致细胞膜破裂;Western Blot结果显示,Necroptosis调控和执行蛋白RIPK3和MLKL在PmPOD作用后磷酸化水平显著增加。同时发现,PmPOD可以通过转录基因的上调诱发肿瘤坏死因子(TNF-α)产生。此外,在HCT116细胞中,PmPOD可以通过使RIPK3启动子区域去甲基化恢复RIPK3在HCT116细胞中的表达。同样去甲基化试剂5-AD和转染过表达RIPK3质粒都可以通过增强RIPK3表达,协同PmPOD诱导HCT116细胞的Necroptosis效应。总的来说,PmPOD诱导结直肠癌细胞Necroptosis至少存在两种机制,自分泌生产Necroptosis诱导因子TNF-?和去甲基化恢复RIPK3表达。同时PmPOD诱导细胞内ROS的升高,且抗氧化剂NAC,BHA可以减弱PmPOD诱导的细胞死亡,表明ROS可能是PmPOD诱导的Necroptosis的一个调节器;PmPOD作用后MDA含量升高,SOD活性、GSH的含量均有下降的趋势,且用Necroptosis抑制剂均能部分逆转上述变化,表明PmPOD会引起细胞的氧化损伤,这可能是细胞ROS升高所做的应激反应。这些结果为深入研究PmPOD诱导肿瘤细胞Necroptosis的机制以及PmPOD的抗肿瘤治疗提供了重要的理论基础和实验依据。