论文部分内容阅读
研究背景与目的：食管癌的治疗主要是手术治疗、放疗、化疗，但由于其早期症状隐匿，就诊时绝大部分的食管癌患者已属于中晚期失去了手术时机，故放射治疗成为了食管癌主要及其有效治疗手段之一。不同食管癌个体之间其放疗敏感性存在差异，由此导致了放疗疗效的差异，因此预测食管癌放射敏感性具有重要的意义。研究显示不同放射敏感性的食管癌细胞具有差异的miRNA表达谱，那不同放射敏感性食管癌组织是否也具有差异表达的miRNA，机制又如何。有研究显示Bmi-1高表达与食管癌放射抵抗密切相关，生物信息软件分析示Bmi-1是miR-203的靶基因之一。本实验旨在研究不同放射敏感性的食管鳞癌病人miRNA的表达差异及miR-203是否能通过下调Bmi-1的表达来增加食管鳞癌TE-1细胞的放射敏感性。方法：1.根据RECIST指南（1.1版本）标准将6例通过同步放化疗的食管鳞癌病人分为敏感组和不敏感组，收集治疗前组织标本并进行配对。应用miRNA芯片检测两组标本miRNA的表达差异，预测其可能的靶基因，选取其中的miR-374c-5p进行食管癌细胞株TE-1的转染，qPCR检测其预测的靶基因CD47，CYFIP2的表达情况。2.结合文献及芯片结果选取miR-203和其靶基因Bmi-1为进一步实验对象，采用LipofectamineTM2000脂质体瞬时转染miR-203模拟物（miR-203mimic）及阴性对照转染序列（miR-203NC）进入食管鳞癌TE-1细胞中，miRNA-203mimics和miRNA-203NC浓度均为50nmol／L，实验共设3组，即miRNA-203mimic转染组、miR-203NC转染组、空白对照组。Westernblot检测Bmi-1蛋白的表达情况，单克隆实验检测TE-1细胞的增殖情况。结果：1.与放射不敏感组比较，放射敏感组中有2个miRNA表达上调超过1.5倍,为miR-1272，miR-5571-5p；有8个miRNA表达下调超过1.5倍，为miR-125b-1-3p,miR-5002-3p,miR-374c-5p,miR-3680-5p,miR-3908,miR-4292,miR-1915-3p,miR-4516。研究显示其中miR-125b-1-3p与多种肿瘤发生、发展及其放化疗敏感性密切相关。2.miR-374c-5p预测的靶基因为CYFIP2， DDIT4， CD47， PTTG1，TNFRSF25，cyclinE2等，这些靶基因与肿瘤凋亡、发生、发展及其预后密切相关。3.qPCR结果显示，与阴性对照组相比，转染组CD47和CYFIP2的表达未见明显降低，差异无统计学意义（P〉0.1）。4.Western blot结果显示，与阴性对照及空白对照组分别比较，转染组中Bmi-1明显降低，差异具有统计学意义（P﹤0.001）；阴性对照组与空白组比较，Bmi-1有所降低，但差异无统计学意义（P〉0.01）。5.克隆形成实验表明过表达miR-203可增加食管癌细胞TE-1放射敏感性。转染组，阴性对照组，空白组的D0依次为1.498、1.6295、1.7，Dq依次为1.3335、1.8578、1.9715，、SF2依次为0.6065、0.73668、0.74595，α/β依次为3.8165、1.0270、1.1409。转染组中D0、Dq、SF2均有所降低，α/β有所升高，差异均具有统计学意义。结论：1.本研究筛选出的10个差异表达的miRNA可能和食管鳞癌放射敏感性相关，其中miR-125b-1-3p与多种肿瘤发生、发展及其放化疗敏感性密切相关，在miR-374c-5p预测的靶基因中CD47、CYFIP2、DDIT4和PTTG1与肿瘤密切相关。2.miRNA-203可通过下调Bmi-1增强食管鳞癌TE-1细胞的放射敏感性。