呼肠孤病毒科病毒是最大的也是具有最广泛宿主谱的dsRNA病毒,其基因组通常由10、11、12节段dsRNA组成。呼肠孤病毒科包括12病毒属,其中轮状病毒(Rotavirus,简称RV)是人和许多动物急性胃肠炎的主要病原,该属分为A-G七个组,A、B、C组RV能够感染人。A组分为15个G血清型(基因型),人群中流行主要是G1、G2、G3、G4等血清型,自上世纪90年代中期开始G9型已经成为全球范围内第五种主要的血清型。改善卫生状况不能降低该病的发病率,研发轮状病毒疫苗是预防控制轮状病毒腹泻的唯一有效的方法。呼肠孤病毒科的其它成员也会感染许多其它生物并引起多种不同的疾病,其中水生呼肠孤病毒,使许多鱼类和其它水生生物致病,如青蟹呼肠孤病毒会感染几种蟹并引起蟹的睡眠病甚至死亡,至今,尚无有效的预防与治疗措施。本文主要研究呼肠孤病毒科的两种病毒:轮状病毒和青蟹呼肠孤病毒,具体内容如下:1.武汉地区G9型A组轮状病毒株的分离培养及初步鉴定经PAGE检测轮状病毒阳性、vp7基因序列分析证实为G9型的武汉市儿童医院采集的腹泻儿童粪便样本,接种MA104细胞,分离得到G9型A组轮状病毒,经PAGE检测证实该病毒与粪便样本轮状病毒核酸呈现相同的带型,蔗糖梯度离心纯化病毒,经磷钨酸负染电镜检测,SDS-PAGE分析纯化的G9型A组轮状病毒蛋白质,克隆vp7基因,测定其基因序列。2.从无感染性的双层粒子拯救感染性轮状病毒从羊轮状病毒LLR感染的MA-104中制备和纯化轮状病毒双层粒子,转染CV-1细胞,转染细胞出现典型的轮状病毒细胞病变效应,转染细胞培养上清免疫胶体金检测轮状病毒阳性。以转染细胞培养上清接种MA104细胞,MA104细胞也产生典型的轮状病毒病变效应,经免疫胶体金检测轮状病毒阳性,成功从无感染性的轮状病毒双层粒子拯救出了有感染性的轮状病毒。3.从体外转录的+ssRNA拯救感染性轮状病毒从羊轮状病毒LLR感染的MA-104中制备和纯化轮状病毒双层粒子,体外转录获得病毒单股正链RNA(+ssRNA),转染CV-1细胞,转染细胞出现典型的轮状病毒细胞病变效应,转染细胞培养上清免疫胶体金检测轮状病毒阳性。以转染细胞培养上清接种MA104细胞,MA104细胞也产生典型的轮状病毒病变效应,经免疫胶体金检测轮状病毒阳性,成功从体外转录的+ssRNA也拯救出了有感染性的轮状病毒。4.锯缘青蟹呼肠孤病毒检测技术研究提取病锯缘青蟹组织处病毒并纯化,电镜负染观察病毒形态,为典型的呼肠孤病毒,GSL方法提取病毒核酸利用PAGE电泳检测出其核酸有12条,呈1/5/6带型,根据锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA聚合酶基因片段序列设计引物,建立一步法RT-PCR方法检测锯缘青蟹呼肠孤病毒,扩增出预期大小片段,扩增片段基因序列分析证实该方法的特异性,利用克隆质粒作为模版检测发现该一步法RT-PCR方法检测灵敏度达10个拷贝。5.锯缘青蟹呼肠孤病毒检测技术和动物模型初步研究从经超薄切片电镜检测和PAGE检测锯缘青蟹呼肠孤病毒阳性的青蟹组织块处粗提锯缘青蟹呼肠孤病毒,经尾节肌肉注射接种市售健康及经RT-PCR检测锯缘青蟹呼肠孤病毒阴性的克氏原螯虾,20天后接种组有一只克氏原螯虾死亡,解剖死亡及未死亡的锯缘青蟹呼肠孤病毒接种的克氏原螯虾,在接种的克氏原螯虾的鳃、肠、肝胰腺、心、尾节肌肉和步足肌肉PAGE均检测到锯缘青蟹呼肠孤病毒,经石蜡切片HE染色显微观察检测和超薄切片负染电镜,在锯缘青蟹呼肠孤病毒接种的克氏原螯虾的鳃、肠、肝胰腺、心、尾节肌肉和步足肌肉中观察到明显的胞浆内包涵体,在鳃、肠、肝胰腺、心、尾节肌肉和步足肌肉超薄切片中胞浆内观察到典型的呼肠孤病毒粒子晶格结构和虾体内各组织处的病毒,成功在克氏原螯虾繁殖青蟹呼肠孤病毒。