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油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)在添加柑桔果胶或羧甲基纤维素钠盐(CMC)的改良Marcus培养液中,可产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸转移消除酶(PGTE)和果胶甲基转移消除酶(PMTE)等5种胞壁降解酶。其中,PG活性最高,酶活达249.11 U/mL。本研究通过丙酮和离心(4℃、8000r/min,15min),从病菌培养滤液中提取PG粗蛋白。将PG粗蛋白依次经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl-Sepharose6 Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,获得具有较高活性的PG纯化蛋白。该PG蛋白分子量为37.17kD,等电点为6.14;含有糖基,含糖量为2.51％,而不含脂类物质,是一种糖蛋白;蛋白部分不含芳香族氨基酸。经测定,这种PG蛋白对高温(≥40℃)不稳定,100℃下水浴20min活性完全丧失;pH3～11范围内均有活性,但pH5时活性最大;对紫外线、氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K均很敏感。
根据GenBank中核盘菌PG基因序列(AF501307和AY312510)特征分别设计引物,通过PCR技术获得油菜菌核病菌两个PG全长基因Sspgld和Sspg3。Sspgld大小为1084bp,推测含有2个内含子,编码326个氨基酸;Sspg3大小为1701bp,推测含有3个内含子,编码482个氨基酸。经BLAST比对,Sspgld与Sspg3分别与已报道的PG基Npgld和pg3序列相似性达100％。
以pET-28a(+)为载体、IPTG为诱导物,将Sspgld和Sspg3基因转入Escherichiacoli BL21(DE3)中进行表达。结果表明,在IPTG诱导下,含有Sspgld和Sspg3基因的转化菌培养破碎上清中PG活性分别为764.35 U/mL和346.72U/mL。