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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是由于动脉壁脂质代谢失衡和免疫功能紊乱而引发的慢性炎症疾病。其中巨噬细胞泡沫化导致脂质在血管内膜的积累是AS发生发展的关键环节。细胞自噬能够抵抗外界的刺激,将细胞内损伤成分降解为小分子物质供机体重新利用,维持能量代谢平衡。相关研究表明,适度的巨噬细胞自噬促进细胞内的胆固醇流出,延缓AS的发生发展。肥胖是AS的高风险因素,治疗肥胖可以使动脉僵硬度恢复正常。气虚体质和痰湿体质是肥胖的两大主要体质影响因素。王琦教授认为肥胖治疗应遵循“益气健运”和“化痰祛湿”两大治法。因此为了系统研究益气健运方药和化痰祛湿方药对动脉粥样硬化的治疗作用及机制,本论文通过小鼠巨噬细胞RAW264.7构建泡沫细胞模型,模拟动脉粥样硬化的形成过程,加入益气健运方和化痰祛湿方药物干预,探索治疗动脉粥样硬化的分子机制。目的:用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,使之成为泡沫细胞,模拟动脉粥样硬化的的形成过程。检测加入药物干预后,巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中自噬功能变化,并探索益气健运方和化痰祛湿方两种药物对AS的调节作用及其机制。方法:培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,构建泡沫细胞模型。将细胞随机分为9组,分别是正常对照组,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)模型组,益气健运方25ug/ml组,50mg/ml组,100ug/ml组;化痰祛湿方25ug/ml组,50mg/ml组,100ug/ml组以及益气健运方与化痰祛湿方合方组(两种药物浓度均为100ug/ml),用油红O染色法检测每组细胞脂质含量。用CD36作为巨噬细胞脂质代谢的标志蛋白,收集蛋白,Westren-blot检测CD36的变化。为研究益气健运方和化痰祛湿方对巨噬细胞自噬影响,收集蛋白,检测Beclin-1、P62、LC3的表达。为了更深一步研究益气健运方和化痰祛湿方对泡沫细胞自噬功能的影响,用自噬蛋白芯片进行研究。结果:1.油红O染色结果显示,在ox-LDL40ng/μl浓度下,细胞脂质含量明显升高,泡沫细胞造模成功。加入益气健运方和化痰祛湿方药物干预后,与造模成功的泡沫细胞相比,药物干预的细胞脂质含量明显降低。2.Western blot结果显示:加入药物干预后,益气健运方组和化痰祛湿方组的CD36表达均升高,药物通过刺激CD36的表达,增强巨噬细胞的脂质处理能力。化痰祛湿方50ng/ul组和益气健运方50、100浓度组的LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比例升高。与模型组相比,化痰祛湿方和益气健运方各浓度组P62表达无显著差异。与模型组相比,化痰祛湿方和益气健运方各浓度组Beclin1表达无显著差异。3.自噬芯片结果显示:①与空白对照DMEM组相比,加入ox-LDL诱导后,溶酶体标志物LAMP1和自噬底物P62的表达升高,说明加入ox-LDL后,巨噬细胞自噬功能确实发生障碍。②与ox-LDL组相比较,化痰祛湿方组P62表达下降,ATG10表达上调。说明加入化痰祛湿方后药物的自噬增强。③与ox-LDL组比较,益气健运方药物组的三个差异基因ATG10、ATG12、ATG4A表达都升高。说明加入益气健运方药物干预后,自噬增强。④与ox-LDL组比较,合方组的ATG10、ATG4A、ATG12、GABARAP基因表达增强,说明加入合方的药物干预后自噬增强。表明益气健运方和化痰祛湿方通过上调自噬进程中ATG系列等基因来增强巨噬细胞自噬。结论:①加入益气健运方和化痰祛湿方药物24h和48h后,25、50、100、150ug/ml浓度药物对细胞活力无明显影响,200ug/ml药物浓度会降低细胞活力。②当加入50、100、150ug/ml的药物后,通过油红O染色,可以明显看出细胞的脂质含量降低,说明益气健运方和化痰祛湿方两种药物均可增加脂质代谢,降低泡沫细胞脂质含量。③自噬蛋白芯片结果显示,加入ox-LDL后,细胞的自噬受阻,加入药物干预后可以恢复自噬。④Western blot结果显示,加入药物干预后LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达增强,CD36的表达增强,说明益气健运方和化痰祛湿方可以增强巨噬细胞的自噬,通过增强自噬作用,促进巨噬细胞的脂质代谢,减少泡沫细胞的形成。