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目的：肝癌全身治疗措施疗效不佳已成为进一步提高肝癌远期疗效的瓶颈。IFN-α具有抗病毒感染、调节机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及抗肿瘤血管生成等生物学作用,目前已被广泛应用于肝癌等恶性肿瘤的防治过程中。但长期大剂量使用IFN-α所导致的毒性反应、产生的耐药性及高昂的治疗费用,限制了IFN-α在临床上的广泛应用。本课题拟就小剂量阿司匹林协同IFN-α诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的作用及其相关机制进行初步研究,以期增强IFN-α(?)临床疗效,减少用药剂量及时间,为临床联合应用小剂量阿司匹林和IFN-α防治肝细胞肝癌提供理论依据和实践基础。方法：(1)分组情况：分为四组,分别为：空白对照组、5000U/ml IFN-α组、小剂量1mM阿司匹林组、5000U/ml IFN-α+小剂量1mM阿司匹林即联合用药组；(2)观察指标及方法：体外培养的人肝癌BEL-7402细胞经IFN-α单独或联合小剂量阿司匹林处理后,采用MTT法测定细胞的增殖情况；流式细胞术分析不同组药物对BEL-7402细胞凋亡的影响,Western Blot检测BEL-7402细胞凋亡相关蛋白表达的变化。(3)信号传导通路等机制研究：采用Western Blot检测IFN-a单独或联合小剂量阿司匹林作用于BEL-7402细胞后JAK-STAT1/3通路的变化；采用实时荧光定量PCR技术检测IFN-α单独或联合小剂量阿司匹林作用于BEL-7402细胞18h时凋亡相关ISGs表达变化情况。结果：1.小剂量阿司匹林可单独并协同IFN-α抑制肝癌BEL-7402细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,处理24h时,小剂量阿司匹林不能抑制肝癌增殖,IFN-α可明显抑制其增殖,联合用药组与IFN-α组相比,差异不具有统计学意义(P＞0.05)；作用48h和72h时,IFN-α和小剂量阿司匹林均可抑制肝癌细胞增殖,联合用药组与单独用药组相比差异具有统计学意义(P<0.05),说明小剂量阿司匹林在作用48h后可单独并协同IFN-α抑制BEL-7402细胞增殖。2.小剂量阿司匹林可单独并协同IFN-α诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡经药物处理48h后,IFN-α组和阿司匹林组细胞凋亡率分别为14.61±2.18%和13.70±0.89%,较空白对照组(9.18±0.79%)差异有统计学意义(P<0.05)；联合用药组细胞凋亡率为31.90±2.25%,与单独用药组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。说明IFN-α和小剂量阿司匹林单独作用48h时均可诱导部分肿瘤细胞凋亡,但二者联合作用时细胞凋亡数量明显增加。3.小剂量阿司匹林通过内源性凋亡通路协同IFN-α诱导肝癌细胞凋亡,该作用与Bax表达的增加有关IFN-α或阿司匹林单独作用于肝癌BEL-7402细胞48h后,细胞caspase-3的表达增加,IFN-α组可见少量caspase-3的激活,caspase-9的表达和活性均明显升高,而caspase-8的表达和活性均未见明显变化,二者联合作用后caspase-3及caspase-9的活性较单独用药组明显增高,提示内源性凋亡通路在二者协同诱导肝癌细胞凋亡过程中发挥着关键作用。进一步检测发现联合用药组促凋亡蛋白Bax表达较单独用药组明显增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1的表达未见明显变化,说明该内源性凋亡通路的启动可能与Bax表达的增加有关。4.小剂量阿司匹林可通过激活STAT1通路增强IFN-α诱导的肝癌细胞凋亡IFN-α可明显激活JAK/STATs通路,其中STAT1和STAT3在其抗肿瘤作用中发挥着重要作用。小剂量阿司匹林可促进IFN-α作用下STAT1的激活,而对STAT3的表达和激活均未产生明显影响。并且,小剂量阿司匹林可促进IFN-α作用下STAT1的表达,由于STAT1表达的降低或缺失会诱导肿瘤细胞IFN-α耐药性的产生,提示小剂量阿司匹林可能具有延缓甚至逆转IFN-α耐药性的作用。5.小剂量阿司匹林增强IFN-α作用下STAT1的激活通过JAK2来实现在人肝癌BEL-7402细胞中,小剂量阿司匹林可促进IFN-α作用下JAK2的激活,但IFN-α对TYK2的激活作用受到抑制,JAK1的激活未被检测到,说明小剂量阿司匹林促进IFN-α对STAT1的激活过程是通过促进其上游通路分子JAK2的磷酸化过程实现的。在JAK2活性被其特异性抑制剂AG490抑制后,IFN-α联合小剂量阿司匹林对STAT1和STAT3的激活均受到明显抑制,说明在肝癌BEL-7402细胞中,JAK2不仅参与了对STAT1的激活,亦参与了STAT3的激活过程。6.小剂量阿司匹林通过调控干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的表达介导了IFN-α诱导的肝癌细胞凋亡采用实时荧光定量PCR结果表明,在作用18h时,小剂量阿司匹林可促进IFN-α作用下促凋亡ISG XAF-1的表达,抑制抗凋亡ISG G1P3的表达。由于XAF-1及G1P3均参与了细胞内源性凋亡途径的调控过程,因此我们推测小剂量阿司匹林协同IFN-α抑制肝癌细胞增殖,促进IFN-α诱导肝癌细胞的凋亡过程,可能与XAF-1表达增加和G1P3表达抑制有关。结论1.小剂量阿司匹林可通过JAK2/STAT1协同IFN-α抑制肝癌BEL-7402细胞增殖,诱导肝癌细胞凋亡；2.小剂量阿司匹林通过内源性凋亡通路诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡,其caspase-9及caspase-3的激活与促凋亡ISG XAF-1的表达增加和抑凋亡ISG G1P3表达的降低相关。