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精子超低温冷冻作为一种可靠、经济、高效的手段可以将优良海水经济鱼种精子长期保存在-198℃的低温中。不仅可以通过这一技术保存濒危和良种鱼类的种质资源,而且可以解决生殖隔离和雌、雄鱼成熟不同步的养殖难题。本研究主要内容为:(1)筛选了鮸鱼精子超低温冷冻中的抗冻保护剂种类、浓度以及降温速率;(2)筛选了赤点石斑鱼精子冷冻的基本方案,并对其进行优化。
鮸鱼是我国水产养殖中的良种鱼类,已有对其精子细胞的超低温冷冻保存技术的初步研究。为了进一步优化鮸鱼精子超低温冷冻保存条件,本实验采集6条性成熟鮸鱼精子细胞,稀释后加入四种抗冻保护剂:DMSO、Gly、EG、PG。这四种抗冻保护剂分为六种浓度:5%、10%、15%、20%、25%、30%。每种处理后的精子分别使用置于液氮面上四种高度进行降温:1cm、3.4cm、5cm、7cm。经过24h的冷冻保存,检测不同处理组冷冻复苏后精子活力和运动持续时间。实验结果显示鮸鱼精子抗冻保护剂的最适浓度范围为5-15%。用15%EG作为抗冻保护剂,以距离液氮面7cm的高度进行降温精子冻后同时具有较好的活力和运动持续时间,分别为(81±5.57%)和(277±46.36s)。
赤点石斑鱼在亚洲东部和南部是一种重要的水产养殖经济鱼类,也是世界自然联盟(IUCN)红色名单中的濒危鱼种。它是一种雌雄同体,雌性先熟的鱼类,要经过很长一段时间才能发育为成熟雄性。而雌、雄鱼成熟不同步成为该鱼种人工养殖上的难题。超低温冷冻可以将过剩的雄鱼精子细胞进行保存,保证雌鱼受精能够随时进行。本实验首次对赤点石斑鱼精子超低温冷冻进行研究,分别用不同渗透压的C-FHBSS、NaCl、Glu和新鲜海水对精子进行激活,发现用1100mOsm/kgGlu激活后精子活力达到(89±2%)。对比前人建立的两种石斑鱼超低温冷冻保存方案,结果显示10%DMSO+10mg/mlBSA作为抗冻保护剂可以使赤点石斑鱼精子冻后具有最高活力(70±4%)。进一步研究降温速率发现使用较快的61℃/min进行降温可以获得较好的保存效果。而10%DMSO与胆固醇晶体组成的抗冻保护剂可以使赤点石斑鱼精子冻后获得较高的活力(77±5%),并且可以将精子运动持续时间提高近一倍。分析鲜精和冷冻后精子膜脂含量发现在冻后活力较好的实验组中精子细胞膜中SM的含量也较高。