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新农药创制的基础是靶标的创新,研究药物作用靶标可以为新农药的创制提供思路,而以天然产物为探针是发现新靶标的主要途径。从植物苦皮藤根皮部分离鉴定出的一系列二氢沉香呋喃多元酯类化合物具有杀虫活性,但其作用机理尚不明确。本文以东方粘虫幼虫(Mythimna separata Walker)为供试昆虫,对二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的作用靶标进行了鉴定和验证,为创制一类作用于昆虫消化系统的新型杀虫剂提供新的思路。主要研究方法与结果如下:1.采用靶标鉴定的亲和层析方法,以苦皮藤素V为二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的代表,在其C-6位衍生合成氨基乙酸酯,通过自发偶联与CNBr活化的Sepharose 4B反应生成亲和基质,从粘虫幼虫中肠BBMV提取物中分离结合蛋白。经质谱鉴定,获得11个如下结合蛋白:锌指蛋白(Zinc finger protein)、跨膜蛋白1(Transmembrane protein 1)、硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase(TPx))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、E3 SUMO-蛋白连接酶RanBP2(SUMO E3 ligase RanBP2)、肌动蛋白(actin)、氨肽酶N3(APN3)、V-ATPase a亚基、B亚基和H亚基。结合文献已报道的前期症状学观察结果及这些蛋白的功能推测可知,APN和V-ATPase为疑似靶酶。2.采用口腔直接饲喂法测定了12个供试二氢沉香呋喃多元酯类化合物对5龄粘虫的毒力,供试化合物KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-异丁酸酯、KV-6-酮、NW57、NW62在供试浓度668.45μg/g剂量下对供试5龄粘虫不表现出胃毒活性;雷公藤次碱(WR)、苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW69、NW03、NW70对供试5龄粘虫有胃毒活性,LD50分别为:0.597、679.479、33.605、767.811、309.559、379.286、86.271μg/g。测定了12个供试二氢沉香呋喃多元酯类化合物对粘虫幼虫中肠APN和V-ATPase活性的影响,结果表明,该类化合物对APN活性没有影响,但是大多数该类化合物对V-ATPase活性有抑制作用。供试化合物苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、KV-6-异丁酸酯、KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、NW69、NW70、NW03、NW57、NW62、雷公藤次碱(WR)对V-ATPase活性的抑制率分别为:14.19%、19.83%、12.72%、12.30%、6.72%、24.04%、12.63%、29.64%、33.98%、1.9%、6.90%、54.78%。供试化合物的杀虫活性与对试虫中肠V-ATPase的抑制活性呈正相关性,说明二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的作用靶酶为V-ATPase。3.基于V-ATPase H亚基功能的重要性,采用RACE技术对粘虫幼虫中肠V-ATPase H亚基进行克隆。获得了粘虫幼虫中肠H亚基基因1807 bp,其中CDS区基因的全长共1425 bp,5’-UTR为136 bp,3’-UTR为246 bp。CDS区编码474个氨基酸,经预测编码氨基酸的分子量为54.8 KDa,等电点(pI)为6.26。4.采用微量热泳动(MST)技术,测定供试12个二氢沉香呋喃多元酯类化合物与H亚基的相互作用,结果表明KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-异丁酸酯、NW57、NW62不与H亚基结合,苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW70、NW69、NW03、雷公藤次碱(WR)与H亚基结合,通过拟合结合曲线计算得解离常数KD值分别为:253.0、144.0、156.0、164.0、186.0、203.0、59.0μM。经过KD值与杀虫毒力LD50及对V-ATPase活性抑制率的相关性分析知,二氢沉香呋喃多元酯类化合物的作用靶标是V-ATPase H亚基。5.借助Discovery Studio软件,采用同源建模法,以已知结构的酵母H亚基为模型,构建了东方粘虫幼虫中肠V-ATPase H亚基的模型,并预测了18个可能的结合位点。利用分子对接技术,将供试12个二氢沉香呋喃多元酯类化合物与H亚基模型对接,通过对接得分与KD值相关性分析可知,位于H亚基C端结构域空腔内的位点17(其氨基酸残基为半光氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)等)为可能的作用位点。