猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一类急性、高度接触性传染病,主要临床症状为呕吐、腹泻、脱水性下痢。因PED对新生仔猪的高致死率,所以每次爆发都会对养猪业造成严重经济损失。我国是主要发病国之一,自2010年起该病的发病率明显升高,且规模更大。由于近年来猪流行性腹泻的频繁爆发,使其成为世界范围的猪传染病。2013年5月美国首次报道猪流行性腹泻案例,并且短时间内迅速扩散蔓延。同年,QiChen等成功分离出美国传播的两株PEDV流行毒株。本实验室近些年来致力于PEDV减毒活疫苗的研究工作,已经取得了一定进展,相继得到了不同类型的重组PEDV,但尚未进行过PEDV流行毒株的分离培养。本实验尝试以Vero细胞分离出PEDV-GJL野毒株,为今后PEDV的疫苗研发和相关基础研究建立基础。纤突蛋白(S蛋白)在决定PEDV宿主噬性方面发挥重要作用,而编码纤突蛋白的S基因突变率较高,S基因的分子流行病学研究在PEDV防控研究中发挥着越来越重要的作用。本研究首先进行样本中PEDV野毒株S基因的分段扩增和基因进化树分析,然后借鉴QiChen等的培养方案,以期在Vero细胞上分离出临床样品中的PEDV-GJL野毒株。基因进化树分析结果显示,样品中两野毒株与国内各地区近几年的流行毒株在同一遗传支系。随后样品中野毒株的分离培养发现得到的毒株在Vero细胞上的CPE并非常见流行毒株的合胞体状态,而是类似DR13毒株引起的病变形态。进一步做对比实验显示病毒的增殖不依赖外界胰酶的存在,故怀疑毒株是DR13毒株。经RT-PCR检测ORF3序列,发现分离到的是PEDV-GJL和疑似DR13减毒疫苗株的混合毒株,并且病毒增殖传至第四代时野毒株PEDV-GJL丢失。取第二代病毒进行两次空斑纯化实验,分别挑取大、小不同蚀斑后得到的病毒经检测发现基因序列与弱毒DR13疫苗株高度同源。由分离纯化结果分析,猪场免疫过弱毒DR13疫苗,采集的临床粪便样品中携带有疫苗毒株。病毒接种后维持液中添加TPB和酵母粉是为了维持营养,但根据本实验结果,可能这套体系对疫苗株的分离更加有利,这个假设还需要后续进一步验证。论文还验证了本实验室的PEDV反向遗传学操作系统,为下步PEDV重组病毒的拯救提供了技术参考。