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目的:建立钳夹型C5脊髓损伤动物模型,用隔日限食进行干预,通过检测脊髓组织中细胞凋亡和坏死性凋亡相关蛋白的表达情况,初步探索隔日限食对急性脊髓损伤大鼠细胞死亡的影响,为隔日限食促进脊髓损伤恢复的作用机制提供实验依据。方法:采用动脉瘤夹钳夹大鼠单侧C5脊髓,建立钳夹型脊髓损伤模型。术前4周,240只大鼠随机分为术前自由饮食组(pre-AL)(180只)和预先干预组(pre-EODF)(60只),pre-AL组大鼠自由摄食、饮水,pre-EODF组大鼠给予EODF干预。4周后,pre-AL组大鼠再随机分为:假手术组(Sham)、自由饮食组(AL)、立即干预组(post-EODF),每组60只。Sham组和AL组术后自由摄食、饮水,post-EODF组术后立即开始EODF干预,pre-EODF组术后继续EODF干预。EODF是指禁食和自由摄食每隔24小时交替进行,但不限制饮水。分别于术后6小时、12小时、24小时、3天、7天采集各组大鼠受损部位的脊髓组织,用免疫组化法检测脊髓中Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达情况,TUNEL法检测脊髓中的细胞凋亡情况,免疫印迹法检测脊髓中TNF-α、RIPK1、RIPK3的蛋白表达情况,髓过氧化物酶试剂盒检测脊髓中MPO的活性情况。结果:1.大鼠饮食和体重(1)饮食:术前1-4周,pre-EODF组大鼠在摄食日的食物摄入量多于同日pre-AL组大鼠的食物摄入量,但总体而言,pre-EODF组大鼠日均摄食量低于pre-AL组,4周内,pre-EODF组大鼠总摄食量为pre-AL组大鼠的81%。术后pre-EODF组和post-EODF组总摄食量低于AL组,其总摄食量分别为AL组大鼠的79%和63%。(2)体重:术前4周,pre-AL组大鼠和pre-EODF组大鼠体重无明显差异(P>0.05),经过1周的EODF干预后,pre-EODF组大鼠体重明显低于pre-AL组大鼠(P<0.05)。术后1周内,4组大鼠的体重均有所下降,随后逐渐上升。2.EODF对脊髓组织细胞凋亡的影响(1)免疫组化检测Bcl-2、Bax和Caspase-3显示:术后各个时间点,Sham组中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白无明显阳性表达,其余三组均有不同程度的阳性表达。术后3d时,pre-EODF组Bcl-2的蛋白表达量明显高于AL组(P<0.05)。术后各个时间点,pre-EODF组Bax的蛋白表达量均低于AL组(P<0.05),并且于术后12h时低于post-EODF组(P<0.05);而post-EODF组在24h、3d和7d时Bax的蛋白表达量也低于AL组(P<0.05)。pre-EODF组Caspase-3的蛋白表达量在术后6h、12h、24h、7d低于AL组(P<0.05),在术后6h、24h低于post-EODF组(P<0.05);而post-EODF组Caspase-3的蛋白表达量在术后12h和7d也明显低于AL组(P<0.05)。同时,与AL组相比,pre-EODF和post-EODF分别使Bcl-2:Bax的比值上升了16%和12%。(2)TUNEL检测细胞凋亡结果显示:术后各个时间点,Sham组脊髓中极少有凋亡阳性细胞表达。pre-EODF组细胞凋亡率在术后6h-3d明显低于AL组(P<0.05),并且在术后6h-24h明显低于post-EODF组(P<0.05),但术后各个时间点,post-EODF组和AL组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。3.EODF对脊髓组织坏死性凋亡的影响(1)免疫印迹法检测TNF-α、RIPK1和RIPK3显示:术后各个时间点,Sham组中TNF-α、RIPK1和RIPK3的蛋白表达均处于较低水平。pre-EODF组TNF-α表达量在术后各个时间点低于AL组(P<0.05),在术后3d时低于post-EODF组(P<0.05);post-EODF组在术后24h、3d时TNF-α表达量低于AL组(P<0.05)。术后6h、12h、24h三个时间点,pre-EODF组RIPK1表达量低于AL组(P<0.05);post-EODF组仅在术后24h时RIPK1表达量低于AL组(P<0.05)。pre-EODF组RIPK3表达量在术后6h、12h、3d、7d均低于AL组(P<0.05),在术后7d时低于post-EODF组(P<0.05);而术后6h和7d,post-EODF组RIPK3表达量也低于AL组(P<0.05)。(2)髓过氧化物酶试剂盒检测MPO显示:术后12h至术后7d,AL组MPO活性明显高于Sham组(P<0.05),pre-EODF组MPO活性明显低于AL组(P<0.05);post-EODF组从术后24h至术后7d,MPO活性也低于AL组(P<0.05)。结论:1.EODF可降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的产生,增加抗凋亡因子Bcl-2的表达,并且脊髓损伤前4周预防性的EODF干预抑制了脊髓损伤后的细胞凋亡。2.EODF可以通过抑制TNF-α、RIPK1和RIPK3蛋白的表达,从而抑制坏死性凋亡通路的激活,降低MPO的活性,这可能是其发挥抗炎作用的机制之一。3.与脊髓损伤后再开始EODF干预相比,脊髓损伤前4周预防性的EODF干预显示出更好的神经保护作用。