糖尿病是以糖代谢紊乱为主的全身常见病，患病率呈逐年上升，据世界卫生组织估计，全球每年新增糖尿病患者100万，到2010年全球糖尿病患病人数将达到3亿，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病重要的并发症，已成为当前中年人群致盲的重要原因。目前对于糖尿病视网膜病变的发病机制还不完全明了。在该病的发生、发展中有多种因素相互作用，如：多元醇代谢通路的异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、蛋白激酶C激活、氧化应激学说、细胞因子的作用和粘附分子的参与等等。长期以来，DR防治和基础研究的重点均针对血管病变，然而有临床实践和基础研究显示糖尿病患者眼底出现可测的微血管改变以前即有视网膜神经功能的改变，临床上表现为色觉和对比敏感度降低，以及视网膜电图的异常。从临床意义来讲，对DR的视网膜神经功能异常的防治意义重大。由于Muller细胞在视网膜内特有的结构和功能，它在这一系列的病理变化中，起着相当重要的作用。视网膜内的神经胶质细胞有Muller细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞，而Muller细胞为视网膜内主要的神经胶质细胞，与视网膜神经元、血管在结构和功能上密切相关。从结构上来看，Muller细胞布满神经视网膜的全层，它的胞体位于内核层，向内发出一级突起通过内丛状层、神经节细胞层和神经纤维层以突触小结终止于内界膜，向外通过外丛状层和外核层，同样以突触小结终止于光感受器细胞的内节，从而形成外界膜；Muller细胞的二级突起可以包绕在神经元胞体、树突、神经纤维层和神经节细胞周围，而它的突触小结与视网膜内的血管鞘都有接触，从某种意义上来说它是视网膜内血管和神经细胞之间的桥梁。Muller细胞在正常视网膜中的功能有：1．通过电压依赖式离子通道和化学依赖式离子通道调节细胞外间质中的离子浓度；2．通过电压依赖式离子通道和化学依赖式离子通道精确的摄取机制以及谷氨酰胺合成酶循环催化作用来调节兴奋性神经递质如谷氨酸的传递；3．通过碳酸氢根离子和CO₂水合作用来调节视网膜内的酸碱平衡；4．通过葡萄糖的摄取、糖原的代谢、有氧和无氧糖酵解来支持视网膜内的各种细胞代谢；5．产生乳酸来支持光感受器细胞的氧化代谢。6．通过释放的化学介质来调节视网膜血管的血流。目前已知，DR时Muller细胞的功能改变可能有以下几种：（1）改变胶质纤维酸性蛋白（glia fibrillaryacidic protein，GFAP）和血管内皮细胞紧密连接相关蛋白Occludin的表达与分布，使血—视网膜屏障（blood-retina barrier，BRB）受到损害；（2）谷氨酸转运体活性的损害和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）的功能降低，以至细胞间质的谷氨酸浓度升高，影响了神经元细胞；（3）Muller细胞在某种情况下向成纤维细胞转化而产生收缩力，参与了增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的发生与发展；（4）K⁺离子通道功能的损害，影响了视网膜的血管功能；（5）Muller细胞内的碳酸酐酶功能受到影响，引起视网膜酸碱平衡失调。本研究的重点在于Muller细胞对谷氨酸循环的调节。文献报道，在DR早期，BRB就会受到损害，从而谷氨酸会渗漏到细胞间质，通常血浆中含有100～300μMol／L的谷氨酸，而只要5μMol／L的谷氨酸就可以对神经节细胞产生严重的损害，如不去除过多的谷氨酸，神经细胞（包括神经节细胞、光感受器细胞等）就会死亡。又有文献报道，在实验性糖尿病大鼠玻璃体和视网膜内可检测到浓度升高的谷氨酸。视网膜中调节谷氨酸平衡主要依靠Muller细胞，Muller细胞通过谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶来来维持正常的谷氨酸循环。谷氨酸转运体将谷氨酸转运入细胞后再由谷氨酰胺合成酶将其转化为谷氨酰胺，从而维持视网膜内谷氨酸的正常水平。所以，不论是谷氨酸转运体还是谷氨酰胺合成酶，出现功能异常的话，都可以使谷氨酸平衡受到影响。目前对于DR谷氨酸循环障碍的研究主要集中在谷氨酸转运体，并已发现谷氨酸转运体发生了异常，而对于谷氨酰胺合成酶的研究比较少。已有文献报道，在2到6月的实验性糖尿病大鼠视网膜中谷氨酰胺合成酶的表达降低，但可能由哪些因素导致未见报道。参考青光眼的研究，近来的发现提示青光眼病变时神经节细胞死亡的主要原因之一是过高浓度的谷氨酸造成的，而谷氨酸循环的障碍与谷氨酰胺合成酶的功能异常紧密相关。所以，我们猜想在糖尿病视网膜病变时，可能也存在某些机制导致的谷氨酰胺合成酶异常。故此，本研究的焦点集中在谷氨酰胺合成酶上。此外，越来越多的研究显示DR的病理过程类似于慢性炎症或免疫反应性疾病，一些免疫相关因子陆续在患有PDR患者的玻璃体和实验性糖尿病大鼠的视网膜中发现，包括白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和IL-8等。其中免疫相关因子IL-1β起着相当重要的作用。有文献报道在DR时它可以通过激活NF-κB途径加速血管内皮细胞的凋亡以致出现毛细血管无细胞化、视网膜内无灌注区的产生以及促进白细胞的粘附、血管渗透性增加等的病理过程。在DR时Muller细胞的功能改变受IL-1β的影响也有文献已报道，包括激活Muller细胞使VEGF的分泌增加，从而引起血管渗透性增加、新生血管形成等一系列病理变化；在众多的生物学功能改变中，很多特有的基因表达主要是受免疫因素诱导引起的，如急性期反应蛋白，它还被认为是一种神经元炎症的反应标志，而这些基因的激活主要还是通过IL-1β的作用来实现的，并认为IL-1β可能是DR时Muller细胞发生一系列功能改变的启动因素。目前在DR中对于免疫因素参与谷氨酸循环障碍的研究尚未见报道，故此本研究利用链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导的糖尿病Sprague-Dawley（SD）大鼠和体外培养的SD大鼠视网膜Muller细胞为研究的在体和离体模型，观察模拟糖尿病环境下IL-1β对Muller细胞谷氨酰胺合成酶的表达影响并探讨可能作用机制。第一部分早期糖尿病大鼠视网膜GS、IL-1β和c-Jun的表达改变第一节糖尿病动物模型的建立和视网膜GS、IL-1β和c-Jun的表达改变目的探讨早期糖尿病大鼠视网膜GS、JL-1β和c-Jun的表达改变。方法链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导糖尿病Sprague-Dawley （SD）大鼠模型，采用免疫组化法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测不同时间（造模成功后1月、2月和3月）大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase，GS）、白细胞介素-1β（IL-1β）和即早基因c-Jun的表达变化。结果实验结果显示，对照组和糖尿病大鼠1、2月组视网膜GS和GS mRNA的表达无明显改变，3月组时GS和GS mRNA的表达明显下调；IL-1β和IL-1βmRNA在对照组视网膜中只有低表达，在1至3月组糖尿病大鼠视网膜中IL-1β和IL-1βmRNA的表达逐渐升高，与对照组相比有显著意义；对照组视网膜中c-Jun和c-JunmRNA只有极低的表达，糖尿病大鼠在1至3月时视网膜中c-Jun和c-Jun mRNA的表达逐渐升高，在3月时尤为明显。结论早期糖尿病大鼠存在着视网膜中GS的表达下降和IL-1β及c-Jun的表达上升，可能存在着IL-1β由c-Jun途径影响GS表达的机制。第二节视网膜Muller细胞的培养及高糖对Muller细胞GS、IL-1β和c-Jun的表达改变目的探讨高糖环境对视网膜Muller细胞GS、IL-1β和c-Jun的表达改变。方法将体外培养的大鼠Muller细胞随机分为对照组（5mMol／l葡萄糖）和实验组（25mMol／l葡萄糖），孵育24小时后采用免疫组化法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检两组细胞内GS和IL-1β和c-Jun的表达改变。结果实验结果显示，高糖环境可以使Muller细胞GS和GS mRNA的表达下降以及IL-1β和IL-1βmRNA和c-Jun和c-Jun mRNA的表达升高，与对照组相比有统计学差异。结论高糖可以使Muller细胞GS的表达下降和IL-1β及c-Jun的表达上升，可能存在着IL-1β由c-Jun途径影响GS表达的机制。第二部分IL-1β对大鼠视网膜Muller细胞GS表达的影响及可能作用机制目的探讨IL-1β对早期糖尿病大鼠视网膜GS表达的改变和可能作用机制。方法（1）．将不同浓度的IL-1β（0，100，500，1000ng／ml）分别注入4组（每组12只）正常大鼠玻璃体腔中，24小时后采用间接免疫荧光法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测视网膜GS和c-Jun的表达变化。（2）．将体外培养的大鼠Muller细胞随机分为对照组（5mMol／l葡萄糖）和实验组（25mMol／l葡萄糖），分别以不同浓度的IL-1β（0，0.1，1，5，10ng／ml）刺激24小时后，采用间接免疫荧光法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测Muller细胞GS和c-Jun的表达变化。结果（1）．玻璃体腔中注射不同浓度的IL-1β24小时后，发现与对照组相比500ng／ml和1000ng／ml的IL-1β可以使GS和GS mRNA的表达明显下调；而与对照组相比100ng／ml的IL-1β就可以使c-Jun和c-Jun mRNA的表达显著升高，并呈剂量依赖性。（2）．不同浓度的IL-1β刺激24小时后，从1ng／ml浓度起Muller细胞中GS和GS mRNA表达随浓度梯度逐渐降低同时出现c-Jun和c-Jun mRNA随浓度增加表达升高。这一结果在高糖状态下尤为明显。结论免疫相关因子IL-1β可使大鼠视网膜GS表达下降，从而影响了谷氨酸的循环，使谷氨酸浓度升高，引起了神经节细胞的死亡。其可能机制为IL-1β激活了c-Jun途径而影响GS的表达。第三部分IL-1ra拮抗IL-1β对大鼠视网膜Muller细胞GS表达的研究目的探讨IL-1ra拮抗IL-1β对大鼠视网膜Muller细胞GS的表达并为可能的干预方法进行初步探索。方法（1）．将不同浓度的IL-1ra（0，500，1000ng／ml）联合1000ng／ml IL-1β分别注入3组（每组9只）正常大鼠玻璃体腔中，24小时后采用间接免疫荧光法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测视网膜GS和c-Jun的表达变化。（2）．将体外培养的大鼠Muller细胞置于高糖（25mMol／l葡萄糖）状态下，一组加入100ng／ml IL-1ra，一组不加IL-1ra；另设2组，一组加入10ng／mlIL-1β和100ng／ml IL-1ra，一组只加入10ng／ml IL-1β，孵育24小时后，采用间接免疫荧光法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测不同情况下的Muller细胞GS和c-Jun的表达变化。结果（1）．玻璃体腔中注射1000ng／ml IL-1β联合不同浓度的IL-1ra 24小时后，在0ng／ml和500ng／ml IL-1ra组对视网膜GS和c-Jun的表达无影响，而在1000ng／ml IL-1ra组可以使GS和GS mRNA的表达明显下调并同时可以使c-Jun和c-Jun mRNA的表达显著升高。（2）．高糖状态下，加入100ng／ml IL-1ra与不加入IL-1ra相比，可以使Muller细胞GS和GS mRNA的表达升高及c-Jun和c-JunmRNA的表达下降；高糖状态下，同时加入10ng／ml IL-1β和100ng／ml IL-1ra与只加入10ng／ml IL-1β相比，后者明显使GS和GS mRNA的表达下降同时使c-Jun和c-Jun mRNA的表达升高。结论上述结果进一步证实了免疫相关因子IL-1β可使GS表达下降，从而影响了谷氨酸的循环；并且其可能机制为IL-1β激活了c-Jun途径而影响GS的表达。提出IL-1ra可能可以作为干预性药物来影响糖尿病视网膜病变发生、发展中IL-1β的作用。第四部分IL-1β对高糖状态下大鼠视网膜Muller细胞增殖和凋亡的影响及可能机制的研究目的探讨IL-1β对高糖状态下大鼠视网膜Muller细胞增殖和凋亡的影响。方法将体外培养的大鼠Muller细胞随机分成对照组（5mMol／l葡萄糖）和实验组（25mMol／l葡萄糖），分别以不同浓度的IL-1β（0，0.1，1，5，10ng／ml）刺激24小时后，采用MTT自动比色法观察两种状态下细胞的增殖情况。同时采用免疫组化法和Western蛋白印迹法观察Muller细胞pSTAT3的表达变化。此外，使用流式细胞仪Annexin V-FITC／PI双染色法测定两组细胞凋亡的情况。结果（1）．两种状态下IL-1β都可以呈剂量依赖地促进Muller细胞的增殖，在高糖状态下，促增殖作用更加明显。IL-1β可以呈剂量依赖地促进两组细胞中的pSTAT3的表达，在高糖状态下尤为明显。（2）．流式细胞仪检测显示不同浓度的IL-1β刺激24小时后，两组细胞随着IL-1β浓度的增加凋亡率无明显改变。结论模拟糖尿病环境下，免疫相关因子IL-1β可使大鼠Muller细胞的增殖明显增加，其可能机制为激活pSTAT3途径；同时未发现相同条件下IL-1β可促使大鼠Muller细胞发生明显的凋亡。