第一部分NLRP3炎性小体和焦亡在心肌缺血再灌注微循环障碍中的作用[目的]探讨NLRP3炎性小体和焦亡在心脏微血管内皮细胞和心肌组织中的作用。[方法]体外实验:利用心脏微血管内皮细胞株(Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)建立缺氧/复氧模型,模拟缺血再灌注过程。在复氧前给予NLRP3抑制剂MCC950或caspase-4抑制剂VX-765预处理CMECs。随后,把培养的CMECs随机分为对照组(normoxia组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+MCC950 组(H/R+MCC950 组)、缺氧/复氧+VX-765 组(H/R+VX-765 组)。使用实时定量PCR反应(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)检测缺氧/复氧对CMECs中NLRP3和IL-1β mRNA水平的影响;采用蛋白质免疫印迹方法(western blot)检测 CMECs 不同组别中 NLRP3、caspase-1、caspase-4、IL-1β 和 GSDMD表达的变化;MCC950预处理后对H/R诱导的CMECs中NLRP3、caspase-1、IL-1β和GSDMD表达的影响;VX-765预处理后对H/R诱导的CMECs中caspase-4和GSDMD表达的影响;采用免疫荧光观察不同组别中NLRP3、caspase-1和GSDMD表达的变化;采用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测不同组别中CMECs毒性的变化。体内实验:选用野生型C57BL/6J雄性小鼠(6-8周龄,体重18-22 g),建立心肌缺血再灌注损伤模型,结扎冠状动脉左前降支45min后解除结扎线进行1 h、6 h和12h再灌注,选取最适再灌注时间进行试验。在建立小鼠缺血再灌注模型前,分别以 15 mg/kg NLRP3 抑制剂 MCC950 和 30 mg/kg caspase-4 抑制剂 VX-765腹腔注射(连续给药3天),在再复灌前15 min在以15 mg/kg(MCC950)和30 mg/kg(VX-765)腹腔注射一次。随后,小鼠随机分组:假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、MCC950+缺血再灌注组(MCC950+I/R组)、VX-765+缺血再灌注组(VX-765+I/R组)。提取各组心脏组织中的蛋白行免疫印迹(western blot)检测,观察不同组别中NLRP3和caspase-4炎性小体相关蛋白表达的变化;免疫荧光观察不同组别中NLRP3炎性小体相关蛋白表达的变化;用免疫组化观察梗死区和梗死周围区巨噬细胞的浸润。[结果]1.RT-PCR结果示:与对照组相比,CMECs中NLRP3和IL-1β表达升高且在H/R2/2h时表达最高(P<0.05,n=3)。2.Western blot结果示:在体外实验中,与对照组(常氧组)相比,缺氧/复氧组(H/R组)CMECs中NLRP3和IL-1β表达升高,尤其在H/R 2/2 h时表达最高(P<0.05,n=3)。随后选取H/R 2/2 h进行试验,观察CMECs中NLRP3和caspase-4炎性小体相关蛋白和焦亡蛋白GSDMD表达的变化。与对照组(常氧组)相比,H/R 组 CMECs 中 NLRP3、caspase-1、caspase-4、IL-1β 和 GSDMD表达升高(P<0.05,n=3)。这些结果表明了 H/R可以诱导CMECs中NLRP3和caspse-4炎性小体活化及CMECs发生焦亡。与H/R组相比,给予不同浓度(1,10,100 μM)NLRP3 抑制剂 MCC950 预处理后,CMECs 中 NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白水平降低(P<0.05,n=3),且浓度为1μM时最佳。与H/R组相比,VX-765(10 μM)预处理后,CMECs中caspase-4及GSDMD蛋白水平降低(P<0.05,n=3)。这些结果表明MCC950和VX-765可以通过阻止NLRP3和caspase-4炎性小体活化来抑制H/R诱导的CMECs焦亡。结果提示NLRP3/caspase-1和caspase-4通路可能参与了 H/R诱导的CMECs焦亡。在体内实验中,与假手术组(Sham组)相比,缺血再灌注组(I/R组)心肌组织中 NLRP3、caspase-l、caspase-4、IL-1 β 和 GSDMD 表达升高,且在 I/R 45 min/6 h时表达最高(P<0.05,n=3)。这些结果表明I/R可以诱导心肌组织中NLRP3和capsase-4炎性小体活化和心肌组织焦亡。3.免疫荧光结果显示:在体外实验中,与对照组(常氧组)相比,H/R组CMECs 中 NLRP3、caspase-1、GSDMD 表达升高。MCC950(1 μM)预处理 CMECs后,CMECs中caspase-1及GSDMD蛋白水平降低。在体内实验中,与Sham组相比,I/R组心肌组织中NLRP3,caspase-1表达升高(P<0.05,n=3)。然而,给予NLRP3抑制剂MCC950预处理组NLRP3和caspase-1表达降低与I/R组相比(P<0.05,n=3)。这就表明NLRP3炎性小体的活化和焦亡可能参与了心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程。4.免疫组织化学结果显示:与Sham相比,I/R组F4/80阳性细胞数和GSDMD阳性细胞数增高(P<0.05,n=3)。与I/R组相比,MCC950+I/R组F4/80阳性细胞数和GSDMD阳性细胞数减少(P<0.05,n=3);与I/R组相比,VX-765+I/R组GSDMD阳性细胞数减少(P<0.05,n=3)。结果表明MCC950或VX-765对心肌缺血再灌注诱导的心肌组织焦亡有一定的抑制作用。5.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示:与对照组相比,H/R组CMECs中乳酸脱氢酶释放增加(P<0.05,n=3);而用MCC950或VX-765预处理可以降低CMECs中乳酸脱氢酶的释放(P<0.05,n=3)。[结论]心肌缺血再灌注可以诱导微血管内皮细胞和心肌组织中NLRP3与caspase-4炎性小体活化和焦亡;而NLRP3抑制剂MCC950和caspase-4抑制剂VX-765可以抑制缺血再灌注诱导的微血管内皮和心肌组织中NLRP3与caspase-4炎性小体活化和焦亡,从而对缺血再灌注诱导的微血管损伤起到保护作用。第二部分Beclin1过表达负性调控NLRP3在心肌缺血再灌注微循环障碍中的作用及机制[目的]探讨beclin1过表达对心肌缺血再灌注诱导NLRP3活化的调控机制。[方法]体内实验:用WT和beclin1过表达C57BL/6J雄性小鼠构建心肌缺血再灌注模型。小鼠随机分组:野生型假手术组(WT组)、beclin1过表达假手术组(BECN1-Tg组)、野生型 I/R组(WT-I/R组)、beclin1 过表达I/R 组(BECN1-Tg-I/R组)。采用TTC和伊文思蓝(Evans blue)双染检测beclin1过表达对心肌缺血再灌注后心肌梗死面积的影响;采用免疫组织化学观察beclin1过表达对心肌缺血再灌注后对缺血区巨噬细胞浸润的影响;采用ELISA观察不同组别小鼠血清中IL-1β的水平;用western blot观察beclin1过表达效果,并检测beclin1过表达对心肌组织中NLRP3和IL-1β表达的影响;应用免疫荧光观察不同组别中NLRP3表达水平。体外实验:应用心脏微血管内皮细胞建立缺氧复氧模型,使用自噬抑制剂3-MA和NLRP3抑制剂MCC950预处理心脏微血管内皮细胞。培养的CMECs随机分为对照组(normoxia组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+MCC950组(H/R+MCC950组)、缺氧/复氧+3-MA组(H/R+3-MA组)。应用western blot检测不同组别中beclin1、LC3、NLRP3、IL-1β表达的水平。构建beclin1过表达慢病毒(Len-becn1)及阴性对照组慢病毒(Len-GFP)转染心脏微血管内皮细胞(CMECs)。转染48 h后,应用荧光显微镜观察转染效果。随后,培养的CMECs随机分为常氧+空载体组(normoxia+Len-GFP)、常氧+beclin1 过表达组(normoxia+Len-becn1组)、缺氧/复氧+空载体组(H/R+Len-GFP组)、缺氧/复氧+beclin1过表达组(H/R+Len-becn1组)。应用western blot和免疫荧光观察不同组别中NLRP3表达的水平。[结果]1.TTC和Evans blue双染结果示:与野生型I/R组相比,beclin1过表达可以降低心肌缺血再灌注后心肌梗死面积(P<0.05,n=5)。2.免疫组织化学组织结果显示:与野生型I/R组相比,beclin1过表达可以减少心肌缺血再灌注后缺血区F4/80阳性巨噬细胞的浸润(P<0.05,n=5)。3.ELISA结果示:与假手术组相比,I/R组小鼠血清中IL-1β水平升高。野生型I/R组相比,beclin1过表达可以降低心肌缺血再灌注后小鼠血清中IL-1β的水平(P<0.05,n=5)。4.Western blot结果显示:在体内实验中,与野生型假手术组相比,beclinl过表达假手术组NLRP3表达水平降低(P<0.05,n=3)。与野生型I/R组相比,beclin1过表达I/R组NLRP3和IL-1β蛋白水平降低(P<0.05,n=3)。结果暗示beclin1可能参与了心肌缺血再灌注诱导的炎症反应调节。在体外实验中,与对照组相比,缺氧/复氧(H/R)可以诱导心脏微血管内皮细胞(CMECs)自噬、NLRP3活化和IL-1β生成,表现为自噬相关蛋白beclin1、LC3Ⅱ水平增加,NLRP3炎性小体通路相关蛋白NLRP3和IL-1β表达增加(P<0.05,n=3);应用自噬抑制剂3-MA预处理CMECs后,自噬相关蛋白beclin1、LC3Ⅱ表达降低(P<0.05,n=3),而NLRP3和IL-1β表达进一步升高(P<0.05,n=3)。结果暗示了抑制自噬可以使CMECs中NLRP3活化更为明显;而使用NLRP3抑制剂MCC950预处理CMECs后,自噬相关蛋白beclin1、LC3Ⅱ表达进一步升高,NLRP3和IL-1β表达进一步降低(P<0.05,n=3)。结果暗示抑制NLRP3表达可以促进CMECs自噬。为进一步探讨beclin1对NRLP3的调控作用,观察慢病毒转染空载体组与beclin1过表达组CMECs中NLRP3表达的变化。与空载体组相比,beclin1过表达组CMECs中NLRP3表达降低(P<0.05,n=3)。这些结果表明了 beclin1过表达可抑制CMECs中NLRP3的活化。[结论]beclin1过表达可能通过调节NLRP3的活化来抑制心肌缺血再灌注诱发的炎症反应,从而对心肌微血管内皮起到一定的保护作用。第三部分Beclin1过表达通过调控TNFAIP3抑制NLRP3活化在心肌缺血再灌注微循环障碍中[目的]探讨TNFAIP3对NLRP3活化的影响及beclin1过表达对TNFAIP3的调控作用在心肌缺血再灌注微循环障碍中。[方法]体外实验:应用CMECs建立缺氧复氧模型,使用自噬抑制剂3-MA和NLRP3抑制剂MCC950预处理CMECs。培养的CMECs随机分为对照组(normoxia组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+MCC950(H/R+MCC950组)、缺氧/复氧+3-MA组(H/R+3-MA组)。应用western blot和免疫荧光观察各个组中TNFAIP3和NLRP3表达的水平。构建过表达beclin1的慢病毒(Len-becn1)及对照组慢病毒(Len-GFP),转染心脏微血管内皮细胞(CMECs),培养的CMECs随机分为空载体组(Len-GFP)、beclin1过表达组(Len-becn1组)、缺氧/复氧+空载体组(H/R+Len-GFP组)、缺氧/复氧+beclin1过表达组(H/R+Len-becn1组)。应用western blot观察不同组别中TNFAIP3表达的水平。体内实验:用WT和beclin1过表达小鼠构建心肌缺血再灌注模型。小鼠随机分组:野生型假手术组(WT组)、beclin1过表达假手术组(BECN1-Tg组)、野生型 I/R 组(WT-I/R 组)、beclin1 过表达 I/R 组(BECN1-Tg-I/R 组)。用 western blot检测各组中TNFAIP3表达的变化。[结果]1.Western blot结果显示:在体外实验中,与对照组相比,缺氧/复氧组(H/R组)CMECs 中 TNFAIP3 表达降低(P<0.05,n=3)。应用 NLRP3 抑制剂 MCC950预处理CMECs后,与H/R组相比,CMECs中NLRP3表达降低,同时TNFAIP3表达增加(P<0.05,n=3)。结果暗示了抑制CMECs中NLRP3表达可以激活TNFAIP3。而使用自噬抑制剂3-MA预处理CMECs后,TNFAIP3表达进一步降低,同时NLRP3炎性小体相关蛋白表达升高(P<0.05,n=3)。结果提示了自噬有可能参与了 TNFAIP3的调控在CMECs缺氧/复氧模型中。因此,我们进一步探讨beclin1对TNFAIP3的调控作用,观察慢病毒转染beclin1过表达组与空载体组CMECs中TNFAIP3表达的变化。与空载体组相比,beclin1过表达组CMECs中TNFAIP3表达增加(P<0.05,n=3)。这些结果表明了 beclin1过表达抑制H/R诱导CMECs中NLRP3的活化可能是通过促进TNFAIP3的表达调节的。在体内实验中,与野生型假手术组相比,beclin1过表达假手术组TNFAIP3表达升高,而NLRP3表达水平降低(P<0.05,n=3)。与野生型I/R组相比,beclin1过表达I/R组TNFAIP3表达升高的同时NLRP3表达水平降低(P<0.05,n=3)。结果与体外一致。2.免疫荧光结果示:与对照组相比,H/R组CMECs中TNFAIP3表达降低,而NLRP3表达升高;给予NLRP3抑制剂MCC950预处理CMECs后,与H/R组相比,CMECs中NLRP3表达升高,而TNFAIP3表达降低;给予自噬抑制剂3-MA预处理CMECs后,与H/R组相比,CMECs中NLRP3表达进一步升高,而TNFAIP3表达进一步降低。[结论]心肌缺血再灌注诱导NLRP3的活化可能是通过抑制TNFAIP3的表达;而beclin1过表达可通过促进TNFAIP3的表达从而抑制心肌再灌注诱导的NLRP3活化。