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目的:通过对慢性乙型肝炎病人、携带者和HBV转基因小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和免疫抑制功能的研究,明确CD4~+CD25~+调节性T细胞在乙肝免疫耐受中的作用,探讨乙肝免疫耐受的发病机制,以寻求打破乙肝免疫耐受和防治慢性乙型肝炎的新途径。方法:1.流式细胞术检测慢性乙型肝炎患者、HBV携带者和HBV转基因小鼠外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞、CD3~+CD4~+CD25~+调节性T细胞数量。2.免疫组化检测HBV转基因小鼠肝脏Foxp3蛋白的表达水平。3.慢性乙型肝炎病人、携带者和HBV转基因小鼠外周血体外经PMA、ionomycin或者IL-2刺激活化后,流式细胞术检测CD3~+CD4~+T细胞和CD3~+CD8~+T细胞胞内IFN-γ的分泌比例。4 .磁珠分选HBV转基因小鼠脾CD4~+CD25-T细胞和CD4~+CD25~+T细胞。5.HBV转基因小鼠脾CD4~+CD25~+T细胞经PMA、ionomycin刺激活化后,流式细胞术检测CD4~+CD25~+T细胞胞内TGF-β分泌比例。6.HBV转基因小鼠脾CD4~+CD25-T细胞体外单独或与自体CD4~+CD25~+T细胞1:1混合培养,分为HBsAg刺激组和ConA刺激组。培养72h后,3H-TdR掺入法检测CD4~+CD25-T细胞的增殖能力,ELISA法检测CD4~+CD25-T细胞分泌IFN-γ、IL-4量。7.相关分析法分析慢性乙型肝炎患者CD4~+CD25~+调节性T细胞数量变化与ALT、HBV-DNA水平的关系。结果:1.与HBV携带者和健康对照相比,慢性乙型肝炎患者外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD4~+CD25~+调节性T细胞数量显著增高(P<0.01),而CD3~+CD8~+T细胞数量明显下降(P<0.01)。HBV携带者与健康对照相比则无明显差异(P>0.05)。2.与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞、CD3~+CD4~+CD25~+调节性T细胞数量无明显差异(P>0.05)。3.与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠肝脏Foxp3蛋白的表达水平无明显差异(P>0.05)。4.与HBV携带者和健康对照相比,慢性乙型肝炎患者外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞分泌IFN-γ比例下降(P<0.01)。HBV携带者与健康对照相比则无明显差异(P>0.05)5.与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠外周血CD3~+CD8~+T细胞分泌IFN-γ比例无明显差异(P>0.05)。6.与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠脾CD4~+CD25~+T细胞分泌TGF-β比例无差异(P>0.05)。7. HBV转基因小鼠脾CD4~+CD25-T细胞与自体CD4~+CD25~+T细胞体外混合培养,在非HBsAg抗原刺激下,CD4~+CD25-T细胞增殖能力和分泌IFN-γ、IL-4水平均与正常小鼠无差异(P>0.05);而在HBsAg抗原刺激下,与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠CD4~+CD25-T细胞增殖能力和分泌IFN-γ、IL-4水平均显著下降(P<0.05,P <0.01)。8. HBV转基因小鼠和正常小鼠CD4~+CD25-T细胞体外单独培养,在HBsAg或ConA抗原刺激下,CD4~+CD25-T细胞增殖能力和分泌IFN-γ、IL-4水平均明显高于混合培养(P<0.01)。9.慢性乙型肝炎患者CD4~+CD25~+调节性T细胞数量变化与ALT正相关(P<0.05),与HBV-DNA无相关性(P>0.05)。结论:1.慢性乙型肝炎患者CD4~+CD25~+调节性T细胞数量增高,CD4~+T细胞功能低下,CD8~+T细胞数量和功能不足。慢性乙型肝炎患者CD4~+CD25~+调节性T细胞数量增高可能是造成HBV免疫耐受的原因。2.与正常同种鼠比较,HBV转基因小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和功能无明显差异,但在T细胞水平对HBV存在特异性免疫耐受。3. CD4~+CD25~+调节性T细胞可非特异地抑制自身活化的CD4~+T细胞、CD8~+T细胞。本研究首次分析了HBV转基因小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和功能,并且进一步分析了慢性HBV持续感染者CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和功能情况,探讨CD4~+CD25~+调节性T细胞在慢性乙肝免疫耐受中的作用,寻求打破慢性乙型肝炎免疫耐受状态,为最终彻底清除病毒打下基础。