目的：　　量子点由于其独特的荧光性质而受到很多重视。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有荧光量子产率高，荧光波长可调，峰型窄而对称，抗漂白能力强等优点。基于这些优点，量子点在生物组织和细胞成像、荧光分析中具有重要应用。其中一个潜在的应用就是在PCR中把量子点作为荧光探针来分析DNA的扩增情况。之前已有研究报道过纳米粒子对PCR中DNA扩增的影响，例如纳米金和巯基乙酸(MAA)修饰的量子点。这些研究指出在适当的浓度下，纳米粒子的加入可以增加PCR扩增的特异性和产率。然而，纳米粒子的浓度对这些结果有重要影响。在较高的浓度下(例如MAA-CdSe大于40 nM)，PCR的扩增会被抑制，产率很低。一般来说，一个PCR过程开始需要95℃下5分钟的热变性，然后是95℃变性，60℃退火和72℃延伸的30-40个热循环，最后是72℃的5-10分钟的延伸阶段。这样高温的反应条件对量子点的稳定性势必会造成影响。然而上述这些报道却没有一个对纳米粒子在PCR热循环的耐受性做系统地研究。最近有一项研究报道了采用辛胺修饰的聚丙烯酸(OPA)包裹的量子点连接DNA引物进行PCR扩增，并得到了一对一的量子点标记的长片段DNA探针。然而在PCR后量子点的荧光强度却有了明显的损失（约30％），这可能是由于OPA的分子量较低，而不能更稳定地包裹量子点的缘故。因此抑制PCR扩增和热循环的不稳定限制了量子点作为荧光探针在PCR领域中的应用。　　在本研究中，我们探索了量子点在PCR和荧光定量PCR反应系统中应用的可行性。我们合成了有机相CdSe/ZnS量子点，并采用高分子量的两亲性聚合物(OPBEM)来包裹有机相合成的CdSe/ZnS量子点，并且选择甲氧基PEG(mPEG)来保护量子点的表面，以此来增加量子点在PCR热循环中的耐受性。测试结果表明，这样修饰的量子点能够在PCR的各种组分中（尤其是Mg离子）耐受40个热循环而几乎不损失荧光强度。在量子点与PCR扩增反应的研究中我们发现量子点与Ex PCR的相容性好明显好于PCR。在Ex PCR中增加Ex Taq聚合酶的浓度可以明显缓解量子点对DNA扩增的抑制。在Real-Time PCR中这种量子点也能够提供稳定可测的荧光。这些探索性的工作为量子点将来在PCR中的应用展示了良好的开端。最后我们又测试了以量子点为荧光供体的分子信标对目的DNA的检测效果。这一应用也同样证明了量子点在PCR体系中作为荧光探针检测DNA的可行性。随着量子点的表面修饰技术、连接技术和荧光共振能量转移技术的发展，量子点可以应用在PCR领域中作为荧光探针进行定量分析。　　方法：　　1.量子点的合成与表征　　采用有机相量子点合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子点。紫外光谱，荧光光谱，透射电子显微镜，XPS能谱，XRD分析等手段对合成的量子点进行表征。　　2.量子点的表面修饰　　采用小分子巯基羧酸MPA和辛胺修饰的高分子PBEM(OPBEM)分别修饰有机相CdSe/ZnS量子点的表面，成功制备水溶性量子点。采用紫外光谱，荧光光谱，透射电子显微镜，DLS分析等手段对合成的水溶性量子点进行表征。　　3.量子点稳定性测试　　分别对MPA和OPBEM包裹制备的水溶性CdSe/ZnS量子点进行稳定性试验，包括电泳稳定性试验和PCR热循环稳定性试验。　　4.OPBEM包裹的量子点以及其表面连接物在PCR热循环中的稳定性测试　　测试了PCR反应体系(包括普通PCR，Ex PCR和Real-time PCR)各组分（包括PCR buffer，dNTP，聚合酶，DNA引物和模板）对量子点在热循环中的荧光稳定性的影响。分别用Tris-base，NH2-mPEG1000和NH2-mPEG2000对量子点表面连接保护，考察这些量子点连接物在热循环中的荧光稳定性。　　5.量子点对PCR扩增反应的影响测试　　考察OPBEM包裹的量子点mPEG2000连接物的引入对PCR扩增的影响情况。　　6.量子点分子信标的合成，表征以及对目的DNA的检测　　合成了量子点分子信标(QDMB)，并对其进行UV光谱和电泳表征。用QDMB对目的DNA进行检测，测试其荧光反弹倍数。　　结果：　　1.量子点的合成与表征　　有机相CdSe/ZnS量子点荧光量子产率为72.74％±10％，TEM照片显示量子点尺寸不超过5nm。XPS分析证明了量子点中含有Zn，S，Cd，Se元素。　　2.量子点的表面修饰　　对有机相CdSe/ZnS量子点进行表面修饰，MPA-CdSe/ZnS荧光量子产率为12.09％±10％，OPBEM包裹的量子点荧光量子产率为34.87％±10％。　　3.不同表面修饰的量子点的稳定性　　电泳试验中高分子包裹的量子点不受电泳溶液环境影响，而MPA修饰的量子点会被淬灭。PCR热循环试验中MPA修饰的量子点发生淬灭或沉淀，不能保持稳定性。OPBEM包裹的量子点能够更好耐受热循环。　　4.OPBEM包裹的量子点在PCR热循环中的稳定性　　采用OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子点QD590进行PCR热循环稳定性试验。发现这种量子点本身可以耐受40个热循环，但是在与PCR组分一起时却容易受到Mg离子的影响。考察了不同QD590连接物对Mg离子耐受的情况并发现QD590-mPEG2000效果最好，连接反应的比例为mPEG2000∶QD590=1000∶1。　　5.量子点对PCR扩增反应的影响　　量子点的引入会抑制PCR扩增反应。这种抑制在Ex PCR体系中比在PCR体系中要减弱很多，增加Ex Taq聚合酶的浓度可以明显缓解这种抑制。在荧光定量PCR的测试中，QD590-mPEG2000有热循环的稳定，可测的荧光信号和较轻的扩增抑制。　　6.量子点分子信标的检测效率　　对两种量子点分子信标QD540MBIBFQ和QD590MBCy5检测互补目的DNA的效果进行了测试。测试结果表明在加入相当于QDMB摩尔数100倍的互补目的DNA时，QD540MBIBFQ的荧光强度反弹倍数为1.4倍，QD590 MBCy5为1.7倍。二者的FRET能量传递效率En分别为28.57％和41.18％。　　结论：　　1.量子点的合成与表征　　本章采用文献中报道的有机相量子点合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子点。紫外光谱，荧光光谱，透射电子显微镜，XPS能谱，XRD分析等手段对所合成的量子点进行了表征。　　2.量子点的表面修饰　　采用小分子巯基羧酸MPA和OPBEM分别修饰有机相CdSe/ZnS量子点的表面，成功制备水溶性量子点。采用紫外光谱，荧光光谱，透射电子显微镜，DLS分析等手段对所合成的量子点进行了表征。　　3.不同表面修饰的量子点的稳定性　　电泳试验结果表明，高分子包裹的量子点比MPA修饰的量子点更能够耐受环境中离子的影响(例如EDTA)。PCR热循环试验表明，高分子OPBEM包裹的量子点比小分子MPA修饰的量子点受热循环温度变化的影响要小。不同荧光波长的OPBEM包裹的量子点有不同的耐受性。　　4.OPBEM包裹的量子点在PCR热循环中的稳定性　　OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子点QD590本身可以耐受40个热循环。QD590-mPEG2000可以有效对抗Mg离子的沉淀作用，连接反应的比例为mPEG2000∶QD590=1000∶1。　　5.量子点对PCR扩增反应的影响　　DNA扩增反应对QD590-mPEG2000的稳定性没有影响。但是量子点的引入却抑制了扩增反应。这种抑制可能是由于纳米粒子对PCR组分的非特异性吸附造成的。这种抑制在Ex PCR体系中比在PCR体系中要减弱很多。增加Ex Taq聚合酶的浓度可以明显缓解这种抑制。在荧光定量PCR的测试中，QD590-mPEG2000有很好的表现:热循环的稳定，可测的荧光信号和较轻的扩增抑制。这为QD590-mPEG2000在荧光定量PCR的应用提供了很好的前景。　　6.量子点分子信标的合成与检测效率　　成功合成并表征了两种量子点分子信标QD540MBIBFQ和QD590MBCy5，对其检测互补目的DNA的效果进行了测试。结果表明在加入相当于QDMB摩尔数100倍的互补目的DNA时，QD540MBIBFQ的荧光强度反弹倍数为1.4倍，QD590MBCy5为1.7倍。二者的FRET能量传递效率En分别为28.57％和41.18％。通过改进量子点的表面修饰技术和开发更有效的量子点与生物分子的连接技术可能进一步提高QDMB的检测效率。