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目的:本研究在生物信息学分析的基础上,克隆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的目的基因并表达其目的蛋白,对棘球绦虫不同组织中的乳酸脱氢酶进行荧光定位,此外,确定乳酸脱氢酶酶促反应的最适反应条件,测定相关酶动力学参数,并进行抑制剂试验。因为乳酸脱氢酶可能是反映寄生虫进行感染和抗感染治疗的重要靶标分子,对棘球绦虫乳酸脱氢酶的性质和功能的研究有助于进一步了解其生长发育特点、入侵与寄生机制,并进而为研发新的诊断和治疗工具奠定基础。方法:采用生物信息学方法分析E.granulosus和E.multlocularis的LDH-A和LDH-B氨基酸序列。分别克隆、表达了E.granulosus和E.multilocularis的LDH-A和LDH-B,并鉴定了这四种抗原诱导机体产生的抗体。检测了四个重组蛋白的免疫反应性,然后通过荧光免疫定位分析不同寄生虫阶段的酶的位置。此外,利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)和乙酰基吡啶-腺嘌呤二核苷酸(APAD),以及底物乳酸,丙酮酸,苹果酸,2-丁酮酸和3-苯丙酮酸评估了四种酶的体外动力学性质。结果:测序和BLAST分析结果显示Eg LDH-A、Eg LDH-B、Em LDH-A和Em LDH-B的开放阅读框为331个氨基酸。尽管这四种LDH同工酶同源物在保守的LDH结构域中显示出相似性,但拓扑结构显示Eg LDH-A与Em LDH-A有94%的同源性,并且与Eg LDH-B和Em LDH-B显示约59%的同源性。在序列上存在一些差异,四种酶中包括7个活性位点残基(189-195),来自Eg LDH-A和Em LDH-A的Val189与来自Eg LDH-B和Em LDH-B的Ile189不同;来自Eg LDH-A和Em LDH-A的3个NAD~+位点残基(Asp53,Arg56,Thr94)与来自Eg LDH-B和Em LDH-B的Asn53,Lys56,Ala94不同;此外,Eg LDH-B和Em LDH-B比Eg LDH-A和Em LDH-A多3个NAD~+位点残基(Gly28-Val30)。PCR扩增E.granulosus和E.multilocularis乳酸脱氢酶A和B(Egldh-A,Egldh-B,Emldh-A和Emldh-B)基因,并将996bp PCR产物连接到p ET28a载体中。在大肠杆菌BL21/DE3中表达r Eg LDH-A,r Eg LDH-B,r Em LDH-A和r Em LDH-B并纯化。四个重组蛋白分别对四种抗原免疫小鼠血清,四种抗原免疫兔Ig G,CE和AE病人血清表现出良好的免疫反应性。免疫定位分析显示天然LDH-A定位于E.granulosus和E.multilocularis的原头节(protoscoleces)胞质部分,但在包囊的生发层表现出微弱的信号;LDH-B主要位于E.granulosus和E.multlocularis原头节生发层。体外酶动力学研究进一步表明在丙酮酸还原反应过程中,四个重组蛋白在最适p H为7.0时具有高催化效率,并且该酶在p H<5.0时无活性。在乳酸氧化反应过程中,r Eg LDH-A和r Em LDH-A的最适p H为9.5,而r Eg LDH-B和r Em LDH-B的最适p H为11.0。在丙酮酸还原反应过程中,四个重组蛋白的最适反应温度为37℃,温度曲线为标准翻转钟形。在乳酸氧化反应过程中,r Eg LDH-B和r Em LDH-B的最佳温度是37℃,而r Eg LDH-A和r Em LDH-A的最佳温度是60℃。NADH,NAD~+,丙酮酸和乳酸(r Eg LDH-A)的Km值分别为0.847 m M,0.207 m M,3.512 m M和119.3 m M;NADH,NAD~+,丙酮酸和乳酸(r Eg LDH-B)的Km值分别为0.286 m M,1.32 m M,1.099 m M和41.7 m M;NADH,NAD~+,丙酮酸和乳酸的(r Em LDH-A)Km值分别为0.294 m M,0.299 m M,1.555 m M和182.6 m M;NADH,NAD~+,丙酮酸和乳酸(r Em LDH-B)的Km值分别为0.345 m M,1.134 m M,0.958m M和40.213 m M。此外,通过比较r Eg LDH-A,r Eg LDH-B,r Em LDH-A和r Em LDH-B的动力学性质,发现四种蛋白质的底物和辅因子中,丙酮酸比2-丁酮酸和3-苯丙酮酸更适合;乳酸比苹果酸更适合;APAD是比NAD~+更好的辅因子。此外,在丙酮酸还原反应或乳酸氧化反应过程中r Eg LDH-B和r Em LDH-B均显示比r Eg LDH-A和r Em LDH-A更高的催化效率(Kcat/Km)。结论:我们从寄生蠕虫中鉴定了四种新型LDH(Eg LDH-A、Eg LDH-B、Em LDH-A和Em LDH-B),并对这些蛋白质的序列和结构进行了综合分析。LDH-A和LDH-B同工酶在E.granulosus和E.multilocularis之间的结构和动力学差异的存在促使我们评估它们作为药物的靶标。