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为得到能直接利用早籼米进行发酵产酒精的融合子,对K氏酵母与黑曲霉分别进行物理诱变,从而筛选得到酒精高产菌株与糖化酶高产菌株。并对两高产菌株分别进行原生质体制备实验,将在优化条件下制备所得原生质体进行电融合,最终选出一株性能稳定、高产酒精的融合子,且摸索出融合子产酒精发酵工艺优化实验条件。主要实验结果见下:
1.K氏酵母对数生长期为4h~10h,酒精耐受性为17%(v/v)。K氏酵母经剂量为0.4KGy的钴源照射后得到酒精高产菌株KC-4酵母,其酒精产量为8.6%(v/v),该产量比原始出发菌株于同等发酵条件下提高41%。黑曲霉在剂量为0.6KGy的钴源照射后得到产糖化酶高产菌株AC-6曲霉,其产糖化酶活力为1026U/g,该糖化酶活力比原始出发菌株于同等发酵条件下所产糖化酶活力提高16.9%。
2.KC-4最佳产孢培养基为1号产孢培养基,且在该培养基上培养的KC-4酵母产孢率为78.34%。菌龄为8h,不经β-巯基乙醇预处理及以0.8mol/L甘露醇为稳定剂时有利于KC-4原生质体形成与再生。KC-4原生质体形成与再生的优化条件为:蜗牛酶浓度2%、酶解温度30℃、酶解时间1.5h,在该条件下KC-4原生质体形成率与再生率分别为72.4%、26.7%。AC-6原生质体再生的最佳菌龄为12h。其原生质体再生优化实验条件为:1.0%纤维素酶+0.5%蜗牛酶+0.5%溶茵酶,30℃,酶解3h时,AC-6原生质体再生率达32.92%。
3.KC-4与AC-6两者原生质体电融合条件为:交变电场频率为1MHz,交变电场强度700v/cm,脉冲电场强度10kv/cm,脉冲宽度50μs,脉冲个数为5个,在该条件下融合率为1.6×10<-4>,AC-6原生质体经紫外线单亲灭活后,在该融合条件下筛选出一株性能稳定,且酒精高产的融合子AK-2。其中该融合子最适生长温度为30℃、最适生长pH为5.0、对数生长期为12h~24h及其酒精耐受度为16%(v/v)。
4.融合子AK-2生料发酵产酒精工艺条件:早籼米最佳粉碎度为60目数,最适接种量为10%,料液比为1:3.0,发酵温度32℃、发酵时间3.5d、pH4.0,且在该优化条件下融合子利用生料发酵产酒精量为7.4%(v/v)。
所得融合子性能稳定,能直接利用生料发酵产酒精,省去传统酒精生产工艺中蒸煮过程,起到节约能耗的优点,具有较强的经济实用价值。