成釉细胞瘤(ameloblastoma，AM)是口腔颌面部最常见的牙源性肿瘤，约占牙源性肿瘤的59.3％。AM虽为良性肿瘤，但具有局部侵袭性，肿瘤细胞常向骨小梁间侵袭生长。临床治疗容易复发，反复多次手术给患者造成严重的面部畸形，并有可能恶变。因此，AM的治疗常使口腔颌面外科临床医生处于两难之地。对AM侵袭机制的研究一直是口腔颌面外科医师最为关心的问题，也是AM研究的难点及热点之一。 到目前为止，成釉细胞瘤的局部侵袭机制尚未明了。一般认为，肿瘤侵袭主要是指肿瘤细胞侵犯和破坏周围正常组织的过程。肿瘤细胞的周边为结缔组织，即基底膜和细胞外基质，这些结构的降解与破坏是肿瘤侵袭转移多阶段过程中的重要步骤。细胞外基质和基底膜的主要组织结构为胶原、层粘素和纤维结合素等，这些结构的破坏与降解需要相应的溶解酶参与。研究表明，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)和相应的基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMPs)在肿瘤的侵袭和转移过程中担任了重要的角色。其中，基质金属蛋白酶—2(MMP—2)是目前研究发现的与肿瘤侵袭关系最为密切的一种基质金属蛋白酶。 已有的研究表明，MMP—2的调节具有三个水平，即基因转录水平、酶原的活化激活水平、抑制剂水平。在本课题组的前期研究中，应用MMP—2的特异化学抑制剂R031-9790明显抑制了MMP—2的活性，并使裸鼠肾包膜下AM移植瘤的生长被抑制。应用靶向RNA干扰技术，特异性的使MMP-2基因沉默，抑制了MMP-2基因的表达，AM的侵袭性被明显抑制，MMP-2与AM细胞的侵袭性密切相关。 TIMP-2是MMP-2的天然抑制剂。TIMP-2基因定位于人17q23-17q25，它编码蛋白分子量为21kDa。TIMP-2与MMP-2形成复合物，抑制明胶酶的活性。TIMP-2既可与活化的MMP-2也可与非活化的MMP-2以共价键形式结合，还可以抑制金属蛋白酶家族所有成员的水解活性。TIMP-2还能抑制肿瘤的血管生成。TIMP-2参与细胞增殖与细胞周期的细胞外基质调控有关。TIMPs对细胞存活的调控机制目前还不确定，可能通过两条路径调节细胞的存活，一个是与其抗MMP活性有关，另外一个是MMP非依赖性途径，包括诱导细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclinependentkinase，CDK)抑制剂p21产生、α-肿瘤坏死因子受体通路、BCL2与BCL-XL通路等。总之，TIMP-2与MMP-2的活性以及肿瘤的侵袭生长密切相关。 本研究旨在将TIMP-2基因转染至成釉细胞瘤细胞，使TIMP-2基因过表达以阻断MMP-2的活性。从而抑制成釉细胞瘤细胞的局部侵袭性生长。探讨TIMP-2基因过表达后成釉细胞瘤细胞侵袭行为的变化，从分子水平阐明成釉细胞瘤细胞侵袭的机制。同时，本研究分别从细胞水平、器官水平以及体内水平观察分析TIMP-2基因转染后成釉细胞瘤细胞、成釉细胞鸡胚尿囊膜移植瘤以及裸鼠皮下移植瘤的生长及侵袭性的改变，为成釉细胞瘤的基因治疗奠定实验基础。 本研究分四个部分： 第一部分TIMP-2真核表达载体的构建及其在成釉细胞瘤细胞的表达研究 目的：构建含有绿色荧光蛋白报告基因的TIMP-2真核表达载体pcDNA3.1(+)/GFP-TIMP-2并转染至体外培养的人成釉细胞瘤细胞。为深入研究TIMP-2基因与成釉细胞瘤局部侵袭生长的关系以及后续实验研究奠定基础。 结论: 1、成功构建带有绿色荧光蛋白报告基因的TIMP—2的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2，经酶切及测序鉴定正确。 2、pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2成功转染至体外培养人成釉细胞瘤细胞，并检测到TIMP—2mRNA表达增加。 3、RPMI1640培养基适用于人成釉细胞瘤细胞的体外培养。 第二部分TIMP—2基因转染抑制成釉细胞瘤细胞侵袭性的实验研究 目的：将第一部分构建的TIMP—2真核表达载体：pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2，转染至体外培养的AM细胞，使TIMP—2基因过表达，从基因及MMP—2天然抑制剂水平调控MMP—2的活性，探讨TIMP—2基因转染后体外培养的AM细胞侵袭性生物学行为的改变，进一步研究MMP—2、TIMP—2与AM局部侵袭性的关系。 结论： 　　1、TIMP—2基因转染AM细胞后，TIMP—2的mRNA及蛋白表达增加，蛋白活性亦增加；MMP—2mRNA表达量无明显改变，其蛋白表达量及活性降低。 　　2、TIMP—2基因转染AM细胞后，细胞的侵袭性被部分抑制。可能机制是TIMP—2基因过表达使MMP—2活性降低所致。 　　3、TIMP—2、MMP—2以及二者的关系可能是影响AM局部侵袭性生长的原因之一。 第三部分TIMP—2基因转染对成釉细胞瘤鸡胚尿囊膜移植瘤影响的实验研究研究 目的：在构建成釉细胞瘤鸡胚尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)移植瘤模型的基础上，通过在移植瘤周围应用TIMP—2真核表达质粒pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2，研究TIMP—2基因转染对成釉细胞瘤鸡胚尿囊膜移植瘤的影响。 结论： 　　1、成功建立成釉细胞瘤的CAM移植瘤模型。 　　2、TIMP—2基因转染后，成釉细胞瘤CAM移植瘤的侵袭性生长被抑制。移植瘤的侵袭性生长被抑制的可能原因是由于特异性抑制MMP—2蛋白引起的。 第四部分TIMP—2基因转染对成釉细胞瘤裸鼠移植瘤影响的实验研究研究. 目的：在构建AM裸鼠皮下移植瘤模型的基础上，通过在裸鼠移植瘤周围注射TIMP—2真核表达质粒pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2，研究TIMP—2基因转染对AM裸鼠移植瘤侵袭性生长的抑制作用。 结论： 1、成功建立AM裸鼠皮下移植瘤动物模型。 2、AM移植瘤的生长被抑制可能是由于TIMP—2基因过表达后，特异性抑制MMP—2蛋白引起的。