金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的革兰氏阳性致病菌,其能够引起广泛的感染并引发多种疾病如中毒性休克、肺炎、皮肤病到严重的心内膜炎、败血症等,此外还可以引起骨髓炎、尿路感染等疾病。目前临床上抗金葡菌感染主要通过联合应用抗生素的方法,但是由于金葡菌抗药性问题不能解决,致使许多抗生素变得无能为力。脂磷壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)是革兰氏阳性细菌细胞壁所特有的、具有高度免疫原性的聚合物,由核糖醇磷酸盐和/或甘油磷酸盐与细胞膜脂质共价结合形成,其为两性分子,一端可以与细胞膜脂质共价结合,另一端可以穿过细胞壁延伸在细胞外。在金葡菌中,脂磷壁酸的缺失会导致细菌停止生长,细胞形态发生严重变化,因此降低了金葡菌的感染能力以及致病性。目前已知脂磷壁酸合成酶LtaS (Lipoteichoic acid Synthase)蛋白在LTA的合成中起主要作用。LtaS蛋白是金葡菌在生长过程中表达的跨膜蛋白,全长646个氨基酸,相对分子质量大小为74.4×103Da,在金葡菌的各菌株中高度保守。已有研究表明,在金葡菌生长过程中,LtaS蛋白胞外217～218位的丙氨酸在细胞外多肽水解酶spsB作用下水解并形成细胞外蛋白eLtaS (Extracellular Lipoteichoic acid Synthase)。同时,人们发现虽然LtaS蛋白合成LTA的活性结构域主要位于其胞外eLtaS的氨基酸残基中,但是体外研究表明,eLtaS蛋白没有合成LTA的生物学功能。因此,受到水解游离在细胞外的eLtaS蛋白其生物学功能目前尚不明确。本研究的第一部分为金葡菌中一种新的补体相互作用蛋白的发现。我们前期研究中构建了金葡菌RNaseⅢ突变菌株(△RNaseⅢ-8325),并发现△RNaseⅢ-8325生长过程中的分泌上清对补体激活有明显的抑制作用。在此基础上,我们将突变株上清与野生型菌株8525-4上清中的总蛋白进行双向电泳分析比较,并将△RNaseⅢ-8325突变株上清中高表达的蛋白进行了质谱鉴定,结果发现有两种蛋白在△RNaseⅢ-8325表达水平明显升高,分别为脂磷壁酸合成酶LtaS蛋白的细胞外部分eLtaS蛋白和糖肽水解酶LtyM。通过基因工程重组表达,我们发现只有eLtaS能够有效的抑制补体介导的红细胞裂解。我们利用基因同源重组方法构建了ltaS的缺失突变菌株(△ltaS-8325),发现ltaS突变株生长较野生型菌株缓慢,将eLtaS蛋白与突变株共培养后对突变株的生长缓慢现象没有回复作用,这也表明eLtaS蛋白在培养上清中不具有合成金葡菌脂磷壁酸(LTA)的功能,同时我们发现突变株在外毒素水平、全血存活率方面都与野生型发生了明显变化。本文的第二部分内容为eLtaS抑制补体激活的机制研究。具体内容如下：1. eLtaS抑制补体激活的机制。在这部分实验中,我们利用CH50和ELISA实验以及进一步的C5a释放检测实验证明了eLtaS是通过与补体C3片段C3d的结合导致C5转化酶失活,进而抑制补体的激活。2. eLtaS与补体C3d相互作用的功能位点的确定。我们利用生物信息学方法模拟了eLtaS与补体C3d的相互作用并预测了其结合位点,然后体外重组表达了相应的突变体蛋白,并在此基础上通过实验学方法确认了二者相互作用的位点。3. eLtaS蛋白与金葡菌致病性的关联性研究。通过构建的肺炎、腹膜炎动物模型,我们发现eLtaS蛋白可以加剧金葡菌8325-4对野生型小鼠肺部的感染以及提高腹膜炎对动物的致死率,但是在C3缺陷性的小鼠模型上,eLtaS则没有明显的加重金葡菌引发的感染。同时我们发现eLtaS蛋白可以抑制中性粒细胞对细菌的吞噬杀伤作用。综上所述,我们的实验结果首先发现LtaS蛋白细胞外部分eLtaS蛋白能够特异结合补体系统的C3d,抑制三条补体通路。进一步的实验结果表明其能够加重金葡菌引发的感染。我们的研究结果表明LtaS蛋白的双功能性,即：其全长形式的LtaS蛋白通过发挥酶学作用,促进LTA的合成。在多肽水解酶作用下生成的eLtaS蛋白不能够促进LTA的合成,但是其能够通过与补体系统相互作用,参与金葡菌的致病过程。我们的研究为抗金葡菌感染研究提供了新的理论基础,同时eLtaS也将有可能成为新抗金葡菌感染的药物靶点。