前言：　　无机砷化物慢性暴露可造成包括神经、心血管、内分泌和呼吸系统在内的全身性损伤以及典型的皮肤损害，并引发多器官癌症，严重危害人类健康。据NRC2007年统计，全球约有2亿人因长期饮用被无机砷化物天然污染的高砷地下水而面临健康威胁。时至今日，饮水型砷中毒依然是全球关注的公共卫生问题。中国是世界上受饮水型砷中毒危害最严重的国家之一，据2013年本研究组发表在《科学》上的一项研究结果显示，我国的砷污染区面积约多达58万平方公里，结合人口分布，预测我国约有1958万人受到高砷饮用水的危害。因此，长期饮用高砷水对人类健康的危害受到了国内外学者的高度关注。　　随着在砷代谢模式研究上的重大突破，人们逐渐意识到砷代谢模式和致病机制关系密切。目前已清楚，无机砷(iAs)进入体内后，在巯基供体谷胱甘肽(GSH)和甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的存在下经过两次氧化甲基化和还原过程，生成多种不同形态和价态的砷化物。进入体内的砷及其代谢产物主要通过尿液排出体外。大量流行病学调查证实，尿液中iAs和MMA越多，DMA越少，表明机体砷甲基化或砷代谢能力越低，其发病风险越大，病情越重。　　我国内蒙古高砷污染区的大样本人群研究显示，高砷暴露人群个体的砷代谢模式呈现多样性。而目前学者们普遍认为遗传因素和外源性因素是造成人群砷代谢模式多样性的主要原因。我们对内蒙古某一高砷暴露人群两年前后的砷代谢模式比较研究显示，研究人群每个个体不同时间点的砷甲基化能力和代谢模式发生了显著变化。这一结果充分说明，在砷代谢和中毒发病过程中，虽然遗传因素起作用，但外源性因素起着更主要的作用。探索外源性因素对砷代谢和毒性影响对砷中毒发生和预防可能更为重要。另外我们通过体外实验发现，外源性给予叶酸干预可以增强Chang肝细胞的砷甲基化能力，拮抗砷所致的氧化损伤。由此可见，膳食中所含的某些营养素可能直接或间接参与到砷甲基化的过程，从而影响砷代谢。　　氧化应激学说是砷中毒发病机制的重要理论之一。大量流行病学调查显示个体甲基化能力的差别能够通过影响机体的氧化应激状态导致人群砷中毒易感性的差异。机体具有一系列复杂的抗氧化防御体系。其中Nrf2-ARE信号通路是其中最重要的一部分。该通路最终通过调控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录和蛋白的表达来降低机体对氧化应激的敏感性，从而阻止相关疾病的发生。而近些年来的研究发现，这一信号传导通路可以被某些抗氧化物质活化，其中尤以十字花科蔬菜等天然食品中所含有的莱菔硫烷(SFN)具有诱发Nrf2的作用倍受关注。　　基于以上理论分析，本研究即采用动物实验与人群干预实验相结合的方法，以影响砷代谢的巯基供体谷胱甘肽(GSH)，甲基供体同型半胱氨酸(Hcy)和诱导Nrf2信号通路表达的天然物质（西兰花粉）为切入点，来探讨上述干预物质对砷甲基化代谢模式和砷所致的氧化损伤的影响，并试图为使用外源性化合物来对抗或缓解砷诱导的慢性损伤的可能性和可行性等提供实验依据。　　方法：　　1、研究对象　　(1)巯基供体(GSH)对饮水砷暴露小鼠砷代谢模式及氧化损伤的影响选择健康、清洁级昆明种雌性小鼠72只，体重(25±2.0)克，适应性喂养一周后，将小鼠随机分成对照组、单纯染砷组，200、400和800 mg/kg体重的GSH腹腔注射干预组和600 mg/kg体重的BSO腹腔注射干预组，每组12只。对照组鼠饮用蒸馏水，其余各组小鼠均自由饮用含砷50 mg/L的亚砷酸钠(NaAsO2)水溶液至实验结束。又分为短期染毒和长期染毒两个亚组，分别为染毒10天和30周。GSH和BSO干预组染毒结束前两日各组给予不同的干预措施。　　(2)甲基供体(Hcy)对饮水砷暴露小鼠砷代谢模式及氧化损伤的影响选择健康、清洁级昆明种雌性小鼠36只，体重(25±2.0)克，适应性喂养一周后，将小鼠随机分为对照组、单纯染砷组和Hcy腹腔注射干预组，每组12只小鼠。对照组鼠饮蒸馏水，其余各组小鼠均自由饮用含砷50 mg/L的NaAsO2水溶液至实验结束。又按干预时间分为两个亚组，即Hcy干预一天组和Hcy干预一周组。　　(3)西兰花粉对模拟砷暴露人群砷代谢模式的影响　　选择健康志愿者共32人，其中男女各16人，身体健康。对照组10人（只服用西兰花粉），牛黄解毒片组6人（只服用牛黄解毒片），牛黄解毒片加西兰花组6人（服用牛黄解毒片和西兰花），海苔组6人（只服用海苔），海苔加西兰花组6人（服用海苔和西兰花）。所有受试对象禁食海产品三天后采清晨尿样10 ml并按组别服用相应食品或药品。牛黄解毒片组和牛黄解毒片加西兰花组服用牛黄解毒片，每次两片，早晚各一次，共服四片;海苔组和海苔加西兰花组一次性食用海苔20 g;牛黄解毒片加西兰花组与海苔加西兰花组在服用牛黄解毒片和海苔后当晚即用200ml室温饮用水与5 g西兰花粉配制成饮品饮用;对照组于同时饮用同样的饮品。服用牛黄解毒片和海苔仅在实验开始前一天进行，西兰花粉在实验开始后每天饮用。实验员监督受试对象按要求进食相应药物，并分别于实验开始后第一、二、四、七、十和十四天采当日晨尿10 ml。本部分研究经中国医科大学伦理委员会审批通过。　　2、指标测定与方法　　(1)尿、肝脏和肾脏中各形态砷含量的测定:氢化物发生-超低温捕集-原子吸收分光光度计法。　　(2)尿肌酐(Cr)含量测定:苦味酸法　　(3)全血、肝脏和肾脏GSH含量的测定:DTNB法　　(4)血清、肝脏和肾脏总抗氧化能力(T-AOC)的测定:比色法　　(5)肝脏MDA含量测定:TBA法　　(6)肝脏和肾脏蛋白含量测定:双缩脲法　　3、统计分析　　实验数据采用SPSS13.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用q检验(SNK)。采用t检验比较2组间数值变量是否具有统计学差异。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。　　结果：　　1、巯基供体(GSH)对砷暴露小鼠一般状态，砷甲基化能力和氧化应激状态的影响　　(1)亚急性砷暴露实验　　所有小鼠用NaAsO2处理过程中均存活。不同组别小鼠体重、饮水量和肾脏脏器系数间均无显著差异，染砷组及iAs+BSO干预组小鼠肝脏脏器系数显著高于对照组。　　各染砷组小鼠尿液、肝脏和肾脏中各形态砷及总砷含量均比对照组有显著升高。与单纯染砷组比较，GSH干预组尿砷的排出量和肾脏中砷的蓄积量显著增加而肝脏中砷的蓄积量显著减少。与GSH干预组相反，BSO干预组尿砷的排出量和肾脏中砷的蓄积量显著减少但肝脏中砷的蓄积量显著增加。与单纯染砷组比较，GSH干预组尿中iAs％显著减少，FMR显著增加，而BSO干预组尿中iAs％和MMA％显著增加，DMA％、FMR和SMR均显著下降;800 mg/kg GSH干预组肝脏MMA％减少，DMA％、FMR和SMR均显著升高;GSH干预组小鼠肾脏iAs％显著低于单纯染砷组，DMA％、FMR和SMR均显著升高，而BSO干预组出现的情况与GSH干预组相反，与单纯染砷组相比，iAs％显著升高，MMA％、DMA％、FMR和SMR水平显著降低。　　与对照组相比，染砷会显著降低血液、肝脏和肾脏中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平，而给予一定剂量的GSH可以有效拮抗砷引起的以上指标的变化。与单纯染砷组相比，BSO干预显著降低血液，肝脏和肾脏中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平。　　(2)慢性砷暴露实验　　所有小鼠用NaAsO2处理过程中均存活。不同组别小鼠体重、饮水量、肝脏和肾脏脏器系数间均无显著差异。　　各染砷组小鼠尿液、肝脏和肾脏中各形态砷及总砷含量均比对照组有显著升高。与单纯染砷组比较，各剂量GSH干预组尿砷的排出量显著增加，肾脏中砷的蓄积量显著增加但肝脏中砷的蓄积量显著减少。与GSH干预组相反，BSO干预组尿砷的排出量显著减少，肾脏中砷的蓄积量显著减少但肝脏中砷的蓄积量显著增加。与单纯染砷组比较，GSH干预组尿中MMA％显著减少，DMA％和SMR显著增加，而BSO干预组尿中iAs％和MMA％显著增加，DMA％显著减少，FMR和SMR均显著下降;800 mg/kg GSH干预组肝脏iAs％、MMA％显著下降，DMA％显著增加，FMR和SMR均显著升高;GSH干预组小鼠肾脏iAs％显著低于单纯染砷组，DMA％、FMR和SMR均显著升高，而BSO干预组出现的情况与GSH干预组相反，与单纯染砷组相比，iAs％、MMA％显著升高，DMA％、FMR和SMR水平显著降低。　　与对照组相比，染砷会显著降低血液、肝脏和肾脏中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平，而给予一定剂量的GSH可以有效拮抗砷引起的以上指标的变化。与单纯染砷组相比，BSO干预显著降低血液，肝脏和肾脏中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平。　　2、甲基供体(Hcy)干预对砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化应激状态的影响　　(1)Hcy干预一天对砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化应激状态的影响　　单纯染砷组和Hcy干预组小鼠尿中各形态砷及总砷含量均高于对照组，Hcy干预组小鼠尿中DMA和TAs含量均显著高于单纯染砷组，而Hcy干预组小鼠尿中MMA％显著低于单纯染砷组而SMR显著高于单纯染砷组。与单纯染砷组相比，Hcy干预组小鼠肝脏iAs、TAs含量和iAs％均显著降低，DMA％、FMR和SMR显著增加;Hcy干预组小鼠肾脏iAs含量和iAs％显著降低，而DMA％和FMR显著增加。　　单纯染砷组小鼠全血和肝脏GSH含量显著低于对照组，Hcy干预组小鼠肝脏GSH含量高于单纯染砷组，肾脏GSH含量各组之间没有显著性差异。单纯染砷组小鼠血清T-AOC显著低于对照组，Hcy干预组小鼠血清T-AOC较单纯染砷组无显著性变化，小鼠肝脏T-AOC在单纯染砷组和Hcy干预组两组之间没有差异，但均显著低于对照组，Hcy干预组小鼠肾脏T-AOC显著低于对照组和单纯染砷组。　　(2)Hcy干预一周对砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化应激状态的影响　　与对照组相比，单纯染砷组和Hcy干预组小鼠尿中各形态砷及总砷含量显著升高，Hcy干预组小鼠尿中MMA、DMA和TAs含量显著低于单纯染砷组，而各形态砷百分比和甲基化率与单纯染砷组无显著性差异。染砷干预组与单纯染砷组比较，小鼠肝脏中DMA和TAs含量显著高于单纯染砷组，而各形态砷百分比和甲基化率的差异均无统计学意义。Hcy干预组肾脏各iAs、DMA和TAs含量均高于单纯染砷组，SMR高于单纯染砷组，但各形态砷百分比和FMR比较没有差异。　　单纯染砷组小鼠全血、肝脏和肾脏GSH水平均低于对照组和Hcy干预组。Hcy干预组小鼠肝脏GSH水平也显著低于对照组。与单纯染砷组相比，Hcy干预组小鼠全血、肝脏和肾脏GSH水平均升高，且差异有统计学意义。单纯染砷组小鼠血清T-AOC显著低于对照组，而Hcy干预组血清T-AOC显著高于单纯染砷组，Hcy干预组小鼠肝脏T-AOC显著高于单纯染砷组，Hcy干预组小鼠肾脏T-AOC显著低于对照组和单纯染砷组。　　3、西兰花粉对人体尿砷甲基化代谢模式的影响　　(1)西兰花粉对服用牛黄解毒片人群砷代谢模式的影响　　牛黄解毒片组人群尿各形态砷及总砷含量均显著高于对照组，且在服药后第一天达到高峰，之后逐渐降低。在第7天后尿中各形态砷及总砷与对照组已没有显著差异。服药后第一天牛黄解毒片加西兰花组尿各形态砷及总砷含量均显著高于牛黄解毒片组。服药后第二天牛黄解毒片加西兰花组尿MMA、DMA及TAs均显著高于牛黄解毒片组。服药后第四天及以后各时间点尿中总砷和各形态砷与牛黄解毒片组相比未见显著性差异。　　服药后第一天牛黄解毒片组和牛黄解毒片加西兰花组人群尿iAs％和MMA％均显著高于对照组，而DMA％、FMR及SMR均显著低于对照组;染砷后第一天牛黄解毒片加西兰花组尿各形态砷及总砷均显著高于牛黄解毒片组，而牛黄解毒片组和牛黄解毒片加西兰花组尿各形态砷百分比及甲基化率未见显著差异。服药后第二天及以后各时间点各组尿中各形态砷百分比及甲基化率无显著性差异。　　(2)西兰花粉对食用海苔人群砷代谢模式的影响　　食用海苔前各组尿各形态砷及总砷含量未见显著差异。食用海苔后尿中iAs和MMA的量与对照组相比没有显著变化。食用海苔后第一、二和四天海苔组和海苔加西兰花组人群尿DMA和总砷含量均显著高于对照组，且在食用海苔后第二天达到高峰。在第7天后尿DMA和总砷含量与对照组已没有显著差异。食用海苔后第二天食用海苔加西兰花组尿DMA及总砷均显著高于海苔组。食用海苔后第四天以后各时间点各组尿中总砷和各形态砷间未见显著性差异。　　食用海苔前各组尿各形态砷百分比及甲基化率未见显著差异。食用海苔后第二天海苔组和海苔加西兰花组人群尿MMA％显著低于对照组，而DMA％和SMR均显著高于对照组;而海苔组和海苔加西兰花组比较尿各形态砷百分比及甲基化率未见显著差异。食用海苔后第四天及以后各时间点各组尿中各形态砷百分比及甲基化率与对照组相比未见显著性差异。　　结论：　　1、外源性GSH干预可以增强砷暴露小鼠的砷甲基化能力，增加砷从尿液中的排出，减少砷在体内的蓄积，从而降低了砷对机体的毒性损伤。　　2、外源性GSH干预可以拮抗砷所致的GSH和T-AOC水平下降，从而减少了砷对机体造成的氧化损伤。　　3、给予BSO耗竭GSH后所产生的效应与GSH干预相反，更加证明了GSH在砷代谢中的重要性。　　4、对砷暴露小鼠进行一天的Hcy干预能增加其砷甲基化能力，促进砷的排出，减少机体的砷负荷。而连续一周给予Hcy干预反而增加了机体的砷负荷，不利于砷从尿中排出。　　5、 Hcy干预可以增加砷暴露小鼠肝脏和血液中的GSH和T-AOC水平。　　6、西兰花粉增加服用牛黄解毒片人群尿砷排泄。　　7、西兰花粉增加食用海苔人群尿砷排泄。