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目的:程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是一种位于T细胞表面的抑制性受体蛋白,和其配体PD-L1共同调节机体免疫反应。肿瘤细胞通过在细胞表面上调PD-L1蛋白表达,与T细胞表面的PD-1蛋白结合后,激活T细胞的PD-1/PD-L1信号通路,抑制机体的免疫系统,从而逃避免疫杀伤。因此,开发以PD-1为靶点的免疫抑制剂一直是抗体药物研发的热点。本实验室在之前的工作中筛选出一株高亲和力的骆驼源PD-1纳米抗体,该课题拟对其进行人源化改造降低免疫原性,为开发一种新的治疗性抗体药物奠定基础。方法与结果:1.本课题采用IMGT区分抗体骨架区和互补决定区规则,手动划分骆驼源PD-1纳米抗体C6以及人源化模板,分别设计了Hu1C6和Hu2C6两条人源化序列。基于分子模拟结果,本课题在Hu2C6基础上回复突变第36位至第50位氨基酸,得到hAC6序列;继续回复突变第5、11、88以及125位氨基酸,得到第四条人源化序列hBC6。2.采用多种质粒和宿主菌的组合在大肠杆菌中表达上述四种人源化纳米抗体重组蛋白:序列Hu1C6未获得表达;其他三条序列使用质粒pET-28a在大肠杆菌中获得表达,但表达产物为包涵体。采用降低诱导温度的方法试图提高蛋白的可溶性表达,效果不显著。在动物细胞表达系统中表达人源化抗体的尝试也未得到很好的效果。3.因此我们采用融合表达的方式,将驼源的纳米抗体C6分别与蛋白标签SUMO、GST、MBP连接起来,在大肠杆菌中进行融合表达,结果显示MBP蛋白促溶效果最强,SUMO蛋白次之,GST蛋白促溶效果最弱。4.进一步将人源化纳米抗体hBC6与SUMO和MBP蛋白标签融合表达,同时构建了hBC6与SUMO和MBP双标签连接的融合表达载体,MBP-hBC6融合蛋白以及MBP-SUMO-hBC6融合蛋白在E.coli中均可以大量表达可溶性蛋白,通过优化酶与底物作用的酶切时间和酶切比例,进行融合蛋白的酶切获得目的抗体。5.通过Elisa法鉴定了3株人源化纳米抗体Hu2C6、hAC6和hBC6的亲和力,证明了抗体可以与抗原PD-1结合,其中hBC6与抗原PD-1结合的能力最强。而MBP-SUMO-hBC6酶切后获得的目的蛋白MS-Cut-hBC6与抗原结合的亲和力高于非融合表达获得的hBC6。EC50和亲和力常数分别为0.997 mg/L和7.52×10~6L/mol。6.采用重组构建稳定表达PD-1的293T细胞和活化的Jurkat细胞检测纳米抗体与细胞上PD-1的结合情况,实验证明了这两株纳米抗体均可以结合细胞上的PD-1蛋白;激活Jurkat细胞与稳定表达PD-L1的Raji细胞共孵育实验中,加入PD-1纳米抗体后发现细胞上清中分泌的IL-2和TNF-α增加,且骆驼源和人源化纳米抗体之间没有统计学差异(p>0.05),说明PD-1纳米抗体可以阻断激活Jurkat细胞与Raji-PDL1细胞结合;同时发现骆驼源纳米抗体C6和人源化纳米抗体hBC6对激活Jurkat细胞促进增殖的作用,人源化纳米抗体hBC6的促增殖作用比驼源抗体更强。结论:本课题对骆驼源PD-1纳米抗体C6进行了人源化改造,并通过在大肠杆菌表达系统中重组表达获得相应的人源化纳米抗体。Elisa法和细胞学实验证明人源化纳米抗体hBC6可以与PD-1蛋白结合,并可以阻断Jurkat细胞PD-1蛋白与PD-L1蛋白结合,从而上调细胞上清中IL-2和TNF-α的表达量。但与骆驼源纳米抗体C6相比,人源化纳米抗体hBC6亲和力低,需要进一步对其进行氨基酸序列优化。