随着结构生物学的不断发展,静态蛋白三维晶体结构已有大量报道,这些晶体结构为基于结构药物设计提供了有价值的信息。单纯利用蛋白晶体结构进行药物设计,存在一些不足之处。只有在某些少数情况下,蛋白处于相对静止的状态,药物分子可以像钥匙插入锁眼中那样,进入到一个相对静态的活性位点中。而在更多情况下,药物分子与蛋白的识别与结合是一个动态的过程。在这一过程中,蛋白的运动变化对于大多数药物分子的结合起到了至关重要的作用。静态的蛋白晶体结构很难提供充足的信息来描述这一过程,不利于提高基于结构药物设计的准确性和合理性。在这种情况下,就需要使用分子动力学模拟的方法,研究蛋白与药物分子相互作用时的动态变化过程,因此,越来越多的研究人员利用分子动力学模拟的方法描述蛋白与药物分子相互作用时的动态变化过程,并且在蛋白及配体构象变化、结合自由能计算以及pH依赖机制等方面取得了进展。但目前还有如下问题难以通过单纯分析蛋白晶体结构得出确切结论,需要利用分子动力学模拟的方法加以分析说明：(1)单纯利用蛋白晶体结构,分析不出蛋白靶点微小结构差异对药物分子(或底物)结合产生显著影响的原因；(2)单纯利用蛋白晶体结构,分析不出受体是如何选择性识别激动剂与拮抗剂；(3)单纯利用蛋白晶体结构,无法量化蛋白活性位点中残基对药物分子结合贡献程度大小。本学位论文就是针对上述三个问题展开研究,论文各部分的主要研究内容和结论如下：第一章绪论中首先阐述了单纯利用蛋白晶体结构进行药物设计的不足之处,并指出分子动力学模拟能够在一定程度上解决这些问题。然后介绍了目前分子动力学模拟在药物设计中的一些应用案例,主要包括：识别蛋白潜在和别构结合位点、采集多种蛋白构象、采集并确定多种配体小分子构象、计算药物分子与蛋白之间的结合自由能、优化蛋白晶体结构、构建伪受体模型以及研究蛋白与小分子配体相互作用过程中的pH依赖机制。在此基础上,提出了本文的科学问题：除了上述应用外,单纯利用蛋白晶体结构进行药物设计还有其它问题,需要利用分子动力学模拟的方法来解决。最后,对本论文的研究内容做了简单介绍。第二章简要介绍了本论文研究工作所需分子动力学模拟的基本理论,主要从分子动力学模拟的基本流程、常用力场、积分方法、温度耦合方法、压力耦合方法、周期边界条件、键长限制算法这七个方面来进行阐述。第三章以人过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)为例,目的是确定PPAR-γ活性位点中哪些残基与罗格列酮相互作用会受到Y473点突变影响。为实现这一目标,本部分研究首先利用分子动力学方法模拟了野生型(WT)、Y473A和Y473F三种PPAR-γ/罗格列酮/辅助活化因子复合物,然后对上述轨迹文件进行氢键作用概率和相互作用能分析。氢键作用概率分析结果表明,点突变可以干扰罗格列酮与S289、H323、H449以及473位残基这四个极性残基之间的氢键相互作用,从而导致罗格列酮与这四个残基总体氢键作用强度被削弱。罗格列酮与PPAR-γ活性位点关键残基相互作用能计算结果表明,Y473点突变会减弱罗格列酮与F282,Q286和Y327之间的相互作用,从而导致PPAR-γ和罗格列酮之间的结合亲和力降低；Y473A点突变还可以使罗格列酮与R288,1341和S342相互作用增强,Y473F点突变还可以使罗格列酮与R288和1341相互作用增强。这样的变化会将罗格列酮拉离AF-2片段,使AF-2片段稳定性降低,导致PPAR-γ转录活性降低。此部分研究结果表明,分子动力学模拟方法可以分析出蛋白靶点微小结构差异对药物分子(或底物)结合产生显著影响的原因。第四章以人蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (PTP1B)为例,目的是确定PTP1B活性位点中D181突变会影响到磷酸化酪氨酸(PTR)底物与PTP1B中哪些残基的相互作用,进而导致底物与PTP1B亲和能力增强。为实现这一目标,本研究首先利用分子动力学方法模拟野生型、D181A和D181E三种不同体系PTP1B与磷酸化酪氨酸底物相互作用,然后对上述轨迹文件进行RMSD、RMSF、动态相关矩阵(DCCM)、主成分分析(PCA)、MM/PBSA,氢键作用概率和相互作用能分析。其中,RMSD、RMSF、DCCM和PCA分析结果表明,D181A能够影响P loop、 WPD loop和其它残基的骨架运动；而D181E只影响到了P loop和WPD loop残基的骨架运动。MM/PBSA计算结果表明,D181A和D181E这两种点突变都能够增强PTP1B与底物之间的亲和能力,这与先前的实验结果相吻合。此外,通过比较MM/PBSA计算出的各项数值,我们发现PTP1B与底物之间的静电相互作用能(△Eele)和溶剂对自由能极性贡献(△Gpol)是造成亲和能力发生变化的主要原因。进一步的氢键作用概率及相互作用能计算结果表明,D181A突变导致PTP1B与底物亲和能力增强,主要是由于其增强了底物与Y46、K120、F182和G218这四个残基之间的作用；D181E突变导致PTP1B与底物亲和能力增强,主要是由于其增强了底物与E181和S216这两个残基之间的作用。此部分研究结果表明,分子动力学模拟方法可以分析出蛋白靶点微小结构差异对药物分子(或底物)结合产生显著影响的原因。第五章以人过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)激动剂13M和拮抗剂471为例,目的是确定PPAR-α活性位点中,哪些残基专门负责激动剂(或拮抗剂)识别。为实现这一目标,本研究首先利用分子动力学方法分别模拟了PPAR-α与激动剂13M和拮抗剂471相互作用,然后对上述轨迹文件进行氢键作用概率和相互作用能分析。在进行氢键作用概率分析时,研究规定与激动剂形成稳定氢键作用,而没有与拮抗剂形成稳定氢键作用的残基是专门负责PPAR-α激动剂识别；相反,与拮抗剂形成稳定氢键作用,而没有与激动剂形成稳定氢键作用的残基是专门负责PPAR-α拮抗剂识别。计算结果表明,激动剂13M与Q277、T279、S280、Y314和H440这五个残基形成氢键作用的稳定性明显高于拮抗剂471。在分析相互作用能计算结果时,研究规定仅与13M有较强相互作用的残基专门负责激动剂识别,那些仅与471有较强相互作用的残基专门负责拮抗剂识别。结果发现,激动剂13M与C275、Q277、T279、S280、Y314、L321、V332、H440和Y464这几个残基的相互作用能显著强于拮抗剂471,而拮抗剂471与I272、I317和I354这几个残基的相互作用能显著强于激动剂13M。根据上述结果可推知,S280、Y314、H440和Y464专门负责激动剂的识别,这与以前的实验研究结果相吻合。除上述四个极性残基外,C275、Q277、T279、L321和V332仅负责激动剂识别。I272,I317和I354仅负责拮抗剂识别。此部分研究结果表明,药物化学家可以利用分子动力学模拟方法分析受体活性位点中对激动剂与拮抗剂起选择性识别作用的残基。第六章以人二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂PS4和B1Q为例,目的是通过比较这两种抑制剂与DPP-Ⅳ残基相互作用的差异,确定哪些残基对抑制剂与DPP-Ⅳ结合的贡献大于活性位点其它残基。我们首先根据DPP-Ⅳ与抑制剂复合物晶体结构对比结果,将现有DPP-Ⅳ抑制剂设计方法分成两大类,分别选择B1Q(IC50=6.8nM)和PS4(IC50=0.38nM)来代表这两种类型的抑制剂。并规定,符合下述两种条件的残基将会被认为对抑制剂与DPP-Ⅳ结合的贡献大于活性位点其它残基：(1)与这两种抑制剂均形成强非价键作用的残基；(2)与PS4的非价键作用明显强于B1Q的残基。然后利用分子动力学的方法分别模拟了DPP-Ⅳ与这两种抑制剂的相互作用,并对轨迹文件进行氢键作用概率和相互作用能分析。结果表明,E205、E206、Q553、Y547和Y662对抑制剂与DPP-Ⅳ结合有显著贡献,这与之前实验研究的结果吻合。此外,F357、S552、K554和Y666也对抑制剂与DPP-Ⅳ结合有显著贡献,在设计DPP-Ⅳ抑制剂时可以考虑与这些残基形成较强的非价键作用(如氢键、盐键、π-π作用等)；R125和N710对抑制剂与DPP-Ⅳ结合贡献有限。此部分研究结果表明,分子动力学模拟能够量化蛋白活性位点中各个关键残基对药物分子结合贡献程度的差异。第七章总结了本论文研究的主要工作内容,提出了本工作的创新之处,并对进一步的相关研究工作做了展望。