【摘 要】
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研究目的:本研究在海南岛发现了一种新型罗非鱼细小病毒（Novel tilapia parvovirus HMU-HKU）,对其进行全基因组扩增、遗传进化分析、流行病学调查及致病性研究,并建立检测方法,为海南岛罗非鱼来源新型细小病毒的基础研究及流行病学调查提供研究基础。研究方法:通过对鳄鱼粪便高通量基因组测序结果的分析,发现了一株与现有细小病毒同源性在核苷酸水平低于10%的新型细小病毒,基于高通量测
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研究目的:本研究在海南岛发现了一种新型罗非鱼细小病毒（Novel tilapia parvovirus HMU-HKU）,对其进行全基因组扩增、遗传进化分析、流行病学调查及致病性研究,并建立检测方法,为海南岛罗非鱼来源新型细小病毒的基础研究及流行病学调查提供研究基础。研究方法:通过对鳄鱼粪便高通量基因组测序结果的分析,发现了一株与现有细小病毒同源性在核苷酸水平低于10%的新型细小病毒,基于高通量测序结果设计特异性引物,验证该病毒的序列,运用PCR、3’RACE和5’RACE的方法拼接新型细小病毒全基因组。采集鳄鱼及罗非鱼粪便样本,设计特异性巢式PCR引物,建立新型细小病毒检测方法,并对新型细小病毒的自然宿主进行溯源,建立新型细小病毒的real-time PCR检测方法,对罗非鱼各个脏器组织携带新型细小病毒载量进行定量。研究结果:通过对鳄鱼粪便进行高通量基因组测序,发现一株新型细小病毒,成功拼接了该新型细小病毒的全基因组,新型细小病毒基因组全长为3566bp,包含两个开放阅读框,分别编码非结构蛋白NS和衣壳蛋白VP1和VP2。G+C含量为43.89%,新型罗非鱼细小病毒的全基因组序列已提交至Gen Bank,登录号为MN162688,遗传进化分析结果表明新型细小病毒与目前报道的细小病毒科其他病毒核苷酸同源性极低小于8%,在氨基酸水平NS1和VP1与其他细小病毒同源性分别低于45.50%和40.38%,根据ICTV细小病毒的最新分类标准,该新型细小病毒属于细小病毒科Chaphamaparvovirus属的新种。本研究进一步对这种新型细小病毒自然宿主进行溯源,对海南岛文昌市两个鳄鱼场的鳄鱼粪便样本进行流行病学调查,结果表明:喂食罗非鱼的鳄鱼粪便阳性率高达86%（43/50）,而喂食鸡的鳄鱼粪便阳性率为4%（2/50）,推测新型细小病毒的宿主可能是罗非鱼,对海南岛六个地区的罗非鱼粪便样本进行流行病学调查结果表明,其阳性率分别为:海口40%（8/20）、定安80%（16/20）、琼海90%（18/20）、乐东0%（0/20）、东方80%（8/10）、琼中0%（0/10）,说明该新型细小病毒的宿主是罗非鱼,进一步研究表明所采集的4种海鱼、5种淡水鱼及1种淡水虾中未检测到该病毒,因此我们将这种新型细小病毒命名为新型罗非鱼细小病毒。本研究建立了针对新型罗非鱼细小病毒的real-time PCR检测方法,其线性范围为1×102-1×108拷贝/μl,扩增系数为0.999,溶解曲线中仅出现一个特定的峰,检测的灵敏度达到了1×102拷贝/μl。罗非鱼各脏器定量结果显示,脾脏病毒含量最高,可达到1×1011copies/g,鱼籽也有感染,说明新型罗非鱼细小病毒可能会通过鱼卵垂直传播给子代。结论:本研究发现了一种新型罗非鱼细小病毒,属于细小病毒科Chaphamaparvovirus属的新种。该病毒在海南岛养殖罗非鱼中广泛存在,而在所检测的海鱼、淡水鱼及淡水虾中未检测到,说明该病毒主要感染罗非鱼。新型罗非鱼细小病毒在罗非鱼体内能够感染大部分组织器官,其中脾脏病毒含量最高,该病毒能够通过鱼卵垂直传播。
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