家蚕(Bombyx mori),又名桑蚕,属鳞翅目家蚕蛾科。其幼虫丝腺具有强大的合成和分泌蛋白质的能力,利用家蚕丝腺生物反应器安全、高效地生产药用蛋白有很好的实用前景。近几年以转基因家蚕表达外源蛋白的技术体系正被逐步建立。人胰岛样生长因子(hIGF- I)具有多种生物学功能,本研究期望通过家蚕转基因实现hIGF- I在丝腺中分泌表达,开辟hIGF- I表达新途径,提高家蚕的利用价值。我们克隆了丝素蛋白重链基因(fibroin heavy chain, fib-H)启动子及其下游信号肽序列即fib-HS;构建了fib-HS控制红色荧光蛋白(DsRed)报告基因的瞬时分泌表达载体pSK- FibHS- DsRed -PolyA;转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed;家蚕注射该载体后,可在丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed分泌到丝腺腔,推测所克隆的序列具有信号肽的功能。以fib-HS控制hIGF- I、家蚕杆状病毒ie-1启动子驱动新霉素抗性基因(neor)构建了基于piggyBac转座子的转基因分泌表达载体pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo,在辅助质粒的存在下,pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转染家蚕BmN细胞,通过G418(终浓度800μg/mL)的压力筛选,获得了稳定表达hIGF-I的转化细胞系,ELISA检测结果显示,hIGF- I在转化细胞中的表达水平约为29.5ng/105cells。采用精子介导法及基因枪法将pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转基因分泌表达载体导入家蚕,通过G418和荧光报告基因(GFP)的双重筛选,在G0代获得3头具有明显绿色荧光的家蚕;用gfp基因的特异性引物可从呈绿色荧光的家蚕基因组中特异性地扩增出gfp基因,表明所获得的荧光蚕为转基因家蚕;反向PCR分析插入位点结果显示,未发现piggyBac转座子特异性插入位点;ELISA检测结果显示,在G0代转基因家蚕的蚕茧中hIGF- I的表达量约756ng/g