结直肠癌(Colorectal carcinoma,CRC)是最常见的十大恶性肿瘤之一,是严重威胁人类健康的重大疾病。结直肠癌的发病率和死亡率在世界范围内日趋迅猛上升,已成为全球第三位最常见的癌症。中国结直肠癌的发病及死亡病例数均居全球第一位,其中发病病例数占全世界发病总例数的18.6%,死亡病例数占全世界死亡总例数的20.1%。近年来多学科综合诊疗模式使得结直肠癌五年的总体生存率得到了一定程度的提高,但大量中晚期结直肠癌患者仍缺乏有效的治疗手段,预后很差。免疫治疗是当前肿瘤领域的研究热点,探讨肿瘤免疫调控的机制,寻找新的干预靶点分子,业已成为该研究领域重要课题方向。B7-H3是B7家族负性共刺激分子成员之一,在多种恶性肿瘤中异常高表达,并与患者预后不良和疾病进展密切相关。B7-H3被认为是肿瘤早期诊断、预后判断的指标以及临床治疗的靶点分子。B7-H3还被认为是“肿瘤相关抗原”,通过非免疫学途径介导肿瘤的恶性进展。因此B7-H3分子在肿瘤的基础研究和临床转化应用是领域中的前沿课题。由于B7-H3的受体或相互作用分子目前尚未确定,B7-H3分子如何发挥作用及其调控机制尚待研究。自噬(Autophagy)是一种高度保守的溶酶体依赖的自身降解途径,对于维持细胞稳态具有重要作用。自噬广泛参与多种生理和病理过程,对细胞生存及死亡起“双重作用”。自噬通过清除细胞内受损变性的蛋白质或细胞器,降解物被重新利用,维持细胞存活;然而过度激活自噬会导致自噬性细胞死亡和组织器官功能损伤。业已表明,肿瘤失控性生长和肿瘤细胞自噬活性的改变密切相关,多种分子参与了肿瘤细胞自噬的调控,发掘其关键分子和阐明其作用机制可为抗肿瘤治疗提供一条新的思路。本课题以B7-H3为靶分子,围绕B7-H3对结直肠癌细胞自噬的调控作用及机制这个主线,通过细胞、分子和体内外不同层面的实验研究,同时结合临床标本分析,深入探讨负性共刺激分子B7-H3调控结直肠癌细胞自噬的作用机制及临床意义,为探索应用B7-H3阻断性抗体与自噬诱导剂联合治疗肿瘤方案打下初步实验基础。第一部分结直肠癌细胞B7-H3的表达与肿瘤细胞自噬的相关性目的:分析结直肠癌细胞自噬发生时B7-H3的表达变化以及B7-H3的表达改变对结直肠癌细胞自噬水平的调控作用。方法:(1)采用结肠癌细胞株HCT116,经si RNA干扰沉默B7-H3的表达后,进行m RNA sequence得到一系列差异表达基因以及通路涉及分子,并对自噬相关基因进行分析;(2)以饥饿诱导细胞自噬的体外培养方法,在两种结直肠癌细胞系HCT116和SW480中,给予营养缺乏培养基EBSS诱导自噬发生,并在不同时间点:0h,1h,2h,4h,2h+medium 2h,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的表达改变;在此基础上,通过转染LC3-GFP慢病毒后在荧光显微镜下观察自噬颗粒来确认细胞自噬的发生;(3)在实验(2)的基础上通过Western blot及流式细胞术检测B7-H3在以上各个时间点的表达水平;(4)采用慢病毒构建干扰B7-H3(sh B7-H3)和过表达B7-H3(LVB7-H3)的HCT116稳转细胞株,分别在正常培养状态下和给予EBSS刺激2 h后,通过Western blot检测各组细胞中LC3B的表达改变;并通过免疫荧光染色观察B7-H3干扰后的HCT116,SW480细胞中LC3B和B7-H3荧光颗粒的变化。结果:B7-H3干扰后m RNA sequence结果分析显示多个自噬相关基因(ATG13、ATG12、ATG16L1、ATG14、ATG2A、LC3B、ULK1、FIP200、p150)表达均显著上调。在HCT116和SW480中加入EBSS诱导2h后,荧光显微镜观察到LC3-GFP自噬颗粒增加。进一步在EBSS处理0h、1h、2h、4h,Western blot检测LC3B II/I,发现LC3B II/I在加入EBSS 1h、2h、4 h后逐渐增加,提示细胞自噬诱导发生,而在加入EBSS 2h再恢复有血清培养2h后,LC3B II/I又恢复到0 h的水平,提示细胞自噬水平恢复。与此同时,利用Western blot以及流式细胞术分析上述各实验组中细胞B7-H3蛋白表达水平,结果显示,B7-H3的表达水平与细胞自噬水平正好相反:当自噬诱导发生时,B7-H3表达下调;而加入正常培养基自噬恢复正常状态时,B7-H3的表达也恢复。在正常状态下以及自噬诱导发生时,分别检测干扰以及过表达B7-H3,HCT116细胞的LC3B表达。结果发现,干扰B7-H3后,LC3B则显著增加;过表达B7-H3后,LC3B则显著降低。同样,LC3B的免疫荧光检测发现:干扰下调HCT116和SW480细胞中B7-H3表达后,胞浆中的LC3B荧光颗粒显著增加。结论:结直肠癌细胞经干扰B7-H3后,多个自噬相关基因表达均显著上调。结直肠癌细胞自噬发生时B7-H3表达下调,自噬恢复正常状态时B7-H3的表达也恢复。干扰B7-H3后细胞自噬水平增加,而过表达B7-H3后细胞自噬水平减低。总之,结直肠癌细胞中B7-H3的表达能抑制肿瘤细胞自噬。第二部分B7-H3通过抑制结直肠癌细胞自噬调控肿瘤细胞生物学功能和代谢目的:观察干扰B7-H3的HCT116细胞自噬状态改变对结直肠癌细胞迁移、增殖、脂质代谢、能量代谢以及体内成瘤的影响,进而探讨B7-H3对结直肠癌细胞自噬的调控作用。通过体内外实验验证B7-H3通过调控自噬促进结直肠癌细胞的生长。方法:(1)以干扰B7-H3的HCT116细胞为研究对象,加入自噬抑制剂3-MA,分别通过迁移实验、增殖实验,检测并比较各组结直肠癌细胞的迁移能力、增殖能力改变,同时检测比较各组细胞的甘油三酯和ATP水平变化;(2)利用过表达B7-H3的HTC116细胞接种裸鼠,待其皮下成瘤后,加入自噬诱导剂—雷帕霉素,监测比较各实验组瘤体大小变化并统计学分析。结果:(1)肿瘤细胞经B7-H3干扰后的增殖和迁移能力显著减弱,而加入自噬抑制剂3-MA可以逆转由该干扰所介导的作用;(2)B7-H3可以通过抑制自噬调控甘油三脂代谢,以及通过抑制自噬调控ATP能量代谢;(3)小鼠成瘤实验显示,B7-H3通过抑制自噬促进结直肠癌细胞体内成瘤能力,加入自噬诱导剂—雷帕霉素后,皮下成瘤缩小能力显著性受到抑制(P=0.0248)。结论:体内外功能试验表明,B7-H3可通过抑制结直肠癌细胞自噬调控肿瘤细胞的生物学功能和代谢改变,并能促进肿瘤细胞的生长。第三部分B7-H3抑制结直肠癌细胞自噬的分子机制目的:在上述结果的基础上,进一步探讨B7-H3抑制结直肠癌细胞自噬的可能分子机制和相关信号传导通路。方法:(1)通过Real time PCR验证m RNA Sequence筛选出的自噬相关差异基因m RNA水平的表达变化;(2)以干扰B7-H3的HCT116细胞作为研究对象,通过Western blot及Co-IP实验逐一验证B7-H3通过Akt/m TOR抑制下游的ULK1-ATG13-FIP200自噬起始复合体的形成,从而抑制结直肠癌细胞自噬发生。结果:(1)通过再次分析B7-H3干扰后的测序芯片数据,发现多个自噬相关基因发生了变化,其中重要的自噬诱导复合体ULK1-ATG13-FIP200的基因表达增加最为显著,m RNA水平检测结果与之前芯片数据一致;(2)Co-IP证实B7-H3干扰后结合FIP200的ULK1和ATG13蛋白均显著增加。进而Western blot检测表明:B7-H3通过m TOR信号来调控Ser757p-ULK1抑制ULK1-ATG13-FIP200复合体的形成;(3)B7-H3干扰后自噬抑制分子p-m TOR、p-Akt表达均下调,进一步Akt激活实验证明B7-H3对m TOR的活化是受到Akt调控的。结论:分子机制研究表明B7-H3对结直肠癌细胞自噬的抑制调控作用是通过激活Akt/m TOR信号通路从而抑制ULK1-ATG13-FIP200复合体的形成来实现的。第四部分B7-H3与自噬相关蛋白LC3B在结直肠癌组织中的表达及临床意义目的:分析B7-H3与自噬相关蛋白LC3B在结直肠癌组织中的表达,进而探讨二者与结直肠癌临床病理因素、患者预后的关系,揭示B7-H3与LC3B共表达在结直肠癌发生发展的作用及预测临床预后的价值。方法:通过免疫组织化学法检测197例结直肠癌组织标本中B7-H3和LC3B蛋白的表达,结合临床病理资料和随访生存时间,采用统计软件SPSS23.0和log-rank检验分析B7-H3与LC3B表达的相关性及临床意义。结果:(1)免疫组化结果统计分析显示:结直肠癌临床组织中B7-H3高表达者占60.4%,B7-H3低表达者占39.6%;LC3B高表达者占26.9%,LC3B低表达者占73.1%。进而统计分析显示:B7-H3高表达与临床预后显著性相关(P<0.001),而LC3B表达与临床病理指标及临床预后无明显相关性;(2)进一步分析发现,结直肠癌肿瘤组织中异常表达的B7-H3与LC3B的表达呈显著性负相关(r=﹣0.16P=0.025)。(3)生存数据分析显示:结直肠癌肿瘤组织中异常高表达B7-H3同时低表达LC3B(B7-H3highLC3Blow)组患者预后最差,而B7-H3低表达同时LC3B高表达(B7-H3lowLC3Bhigh)组患者预后最好(P=0.001)。结论:B7-H3在结直肠癌组织中呈异常高表达,与患者临床预后显著性相关。LC3B在结直肠癌组织中呈低表达,LC3B与B7-H3的表达之间呈显著性负相关。B7-H3与LC3B联合检测对预测结直肠癌患者的预后具有一定临床价值。综上所述,本研究从现象-功能-机制-临床资料等多方面探讨负性共刺激分子B7-H3对结直肠癌细胞自噬水平调控进而促进肿瘤细胞生长的作用机制和临床价值,从而揭示了B7-H3通过抑制自噬促进肿瘤细胞生长的新机制。本研究不仅为B7-H3在结直肠肿瘤组织高表达导致病人预后不良提供重要的理论依据,也将为下一步B7-H3阻断性抗体联合自噬诱导剂的治疗肿瘤方案奠定实验基础和理论支撑。