已酮可可碱对神经病理性疼痛及其相关细胞因子的影响目的神经病理性疼痛是指中枢或外周神经系统损伤或疾病造成的疼痛综合症。近年研究表明外周、甚至中枢免疫系统的激活参与了神经病理性疼痛的过程。神经系统与免疫系统之间可通过递质、神经肽、细胞因子及其配体产生相互作用，其中细胞因子是联系神经-免疫反应的关键分子。尽管对细胞因子在神经病理性疼痛中的作用进行了大量研究，但研究结果尚有分歧。并且由于不同的细胞因子在病理性疼痛中的作用可能不同，并且细胞因子的表达时间特点依赖于不同的动物模型和测定的组织类型和部位，因此对细胞因子在神经病理性疼痛的发生发展中的作用仍需作进一步的评价。己酮可可碱（PTX）是甲基黄嘌呤衍生物，早期多用于治疗脑血管疾病和外周血管疾病，90年代后期，在体外培养细胞发现PTX可剂量依赖性地抑制细胞因子的分泌。近来发现PTX是胶质细胞代谢抑制剂，可以有效地通过血脑屏障，并且能通过多种机制发挥神经保护作用。在一些炎症性疼痛模型上观察到PTX的镇痛作用，但由于炎症性疼痛和神经病理性疼痛的机制存在差别，PTX是否可抑制神经病理性疼痛尚不明了。因此，本研究拟在坐骨神经慢性结扎所致神经病理性疼痛模型上通过全身给药，观察已酮可可碱是否对神经病理性疼痛具有镇痛作用；在此基础上，采用荧光定量PCR技术（FQ-RT-PCR）和双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法分别动态检测慢性坐骨神经结扎损伤（chronic constriction injury CCI）后大鼠脊髓中TNFα、IL-1β、IL-6mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其在神经病理性疼痛发生发展中的意义。同时观察已酮可可碱对脊髓中上述细胞因子的影响，探讨已酮可可碱的作用机制，为其临床应用提供理论依据。已酮可可碱对神经病理性疼痛的作用实验材料1、实验动物选用健康成年雄性Sprague Dawley大鼠，实验前体重250±20g，由徐州医学院实验动物中心提供。2、主要试剂和药品已酮可可碱（石家庄制药厂，批号：0504009—P6001）3、主要仪器Von Frey细丝（stoleting公司，美国）；BME-410A型热痛刺激仪（中国医学科学院生物工程研究所，中国）；实验方法1、慢性坐骨神经结扎损伤（Chronic ConstrictiOil Injury，CCI）模型的制作戊巴比妥钠40mg／kg腹腔注射后，选择左侧后肢，暴露坐骨神经，以3.0丝线相隔1mm松结扎4道，至神经外膜稍稍受压为止，逐层缝合。假手术组步骤与神经结扎组大鼠相同，但仅进行分离坐骨神经手术操作，不结扎坐骨神经。2、动物分组动物随机分为3组：假手术组（Sham组）、神经结扎组（CCI组）和已酮可可碱组（PTX组）（n=8），CCI组如上所述进行坐骨神经结扎；Sham组手术步骤与CCI组相同，但仅暴露坐骨神经并游离连接组织，而不行坐骨神经结扎；PTX组进行坐骨神经结扎，并于术前1天开始至取材点每天腹腔注射PTX100mg·kg^-1，CCI组和Sham组腹腔注射相同容积的生理盐水。各组分别于手术后1，3，7，11，14，21天观察机械缩足反射阈值（Mechanical Withdrawal Threshold，MWT）和热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。3、统计学处理数据均以均数±标准差表示，所得数据经SPSS13.0软件处理，以P<0.05认为差异有统计学意义。其中机械性缩足反射阈值组间和不同时间点间比较采用非参数检验中的两个独立样本Mann-Whitney检验；热缩足反射潜伏期采用重复测量的方差分析（ANOVA），用Tukey’s检验进行两两比较。用Microsoft Excel 2003软件进行绘图。实验结果1、左侧坐骨神经结扎对大鼠同侧后足热缩足反射潜伏期（TWL）的影响各组间MWT基础值无显著性差异。坐骨神经结扎术后1天，CCI组大鼠MWT即显著降低，低于术前的基础值（P<0.01），与sham组比较也有统计学差异（P<0.01）。CCI后1天、3天、7天、11天、14天、21天大鼠的MWT与其自身基础值相比分别降低81.5％，82.2％，84.7％，76.6％，73.4％和70.2％；与术前及sham组比较，CCI组大鼠MWT持续降低至术后21天（P<0.01）。2、左侧坐骨神经结扎对大鼠同侧后足热缩足反射潜伏期（TWL）的影响各组间TWL基础值无显著性差异。坐骨神经结扎术后第1天，CCI组大鼠TWL即显著降低，并且低于术前的基础值（P<0.05），与sham组比较也有统计学差异（P<0.05）。CCI后1天、3天、7天、11天、14天、21天大鼠的TWL与其自身基础值相比分别降低33.5％，47.8％，45.6％，46.7％，44.5％和40.7％；与术前及sham组比较，CCI组大鼠TWL持续降低至术后21天（P<0.05）。3、已酮可可碱对左侧坐骨神经结扎大鼠同侧后足机械性缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）的影响组间MWT和TWL基础值无显著性差异。PTX组大鼠术后各时间点的MWT虽仍低于术前基础值（P<0.05），但与CCI组比较，PTX组大鼠术后各时间点的MWT均显著升高（P<0.01或P<0.05）。PTX组大鼠术后各时间点的TWL虽仍低于术前基础值（P<0.05），但与CCI组比较，PTX组大鼠术后各时间点的TWL均显著升高（P<0.01）。已酮可可碱对神经病理性疼痛相关细胞因子的影响第一部分、已酮可可碱对大鼠脊髓TNFα、IL-1β、IL-6蛋白含量的影响实验材料1、实验动物同论文一。2、主要试剂和药品TNFα、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（北京中杉公司）；3、主要仪器恒温箱（苏州医疗设备厂）；移液器（Gilson公司）；电子天平（Denver InstrumentCompany A-200型，DS美国）；高速离心机（CS-15R，美国Beckman）；酶标仪（Moae1550，美国BIO-RAD公司）；实验方法1、CCI动物模型制作同论文一。2、实验分组90只大鼠随机分为sham组、CCI组和PTX组。各组又根据存活的时间不同分为5个亚组（n=6），分别在术前、术后1天、7天、14天和21天处死大鼠，取腰段脊髓。3、ELISA检测按照试剂盒说明书操作。4、统计学方法计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。运用SPSS13.0统计软件包进行分析。P<0.05为差异有显著性。实验结果1、PTX对CCI大鼠脊髓TNFα蛋白含量影响与sham组比较，CCI组术后1d、7d和14d脊髓中TNFα蛋白含量明显升高（P<0.05），其中术后7d时TNFα蛋白含量最高（P<0.01）。CCI组术后1d，7d，14d时的TNFα蛋白含量分别为sham组的3.44，5.26，3.29倍。PTX组脊髓中TNFα蛋白含量在术后1d，7d和14d时明显降低（P<0.01），分别为CCI组的48％，49％，52％。术后21d时，三组间脊髓中TNFα蛋白含量无明显差别（P>0.05）。2、PTX对CCI大鼠脊髓IL-1β蛋白含量影响与sham组比较，CCI组IL-1β蛋白含量于术后1天开始升高，持续至术后14天（P<0.01）。CCI组术后1d，7d，14d时的IL-1β蛋白含量分别为sham组的2.98，3.16，2.95倍。与CCI组比较，PTX组各时点IL-1β蛋白表达均明显降低（P<0.05或P<0.01）。PTX组术后1d，7d，14d时的IL-1β蛋白含量分别为CCI组的57％，51％，64％。术后21d时，三组间脊髓中IL-1β蛋白含量无明显差别（P>0.05）。3、PTX对CCI大鼠脊髓IL-6蛋白含量影响与sham组比较，CCI组术后1天即出现IL-6蛋白含量升高，于术后7天达到高峰，14天时仍然较高，并且一直持续至术后21天（P<0.05或P<0.01）。CCI组术后ld，7d，14d，21d时的IL-6蛋白含量分别为sham组的3.74，5.33，2.76，2.74倍。与CCI组比较，PTX组各时点IL-6蛋白表达均明显降低（P<0.05）。PTX组术后1d，7d，14d，21d时的IL-6蛋白含量分别为CCI组的54％，50％，68％，58％。第二部分、荧光定量RT-PCR检测神经病理性疼痛大鼠脊髓TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表达变化及已酮可可碱对其的影响实验材料1、实验动物同第一部分。2、主要试剂和药品DEPC（Sigma公司，美国）；Trizol（Invitrogen公司，美国）；氯仿；异丙醇；75％酒精，用DEPC处理水配制；RNase-free水，用0.01％DEPC处理过夜、消毒；SupperScriptⅡ逆转录试剂盒（Invitrogen公司，美国）；Taq DNA聚合酶（上海申能公司）；引物和Taqman探针（上海生工生物公司合成）；Q-PCR buffer（美国ABI公司）；其他试剂均为进口或国产分析纯。3、主要仪器Perkin Elmer 9600 PCR扩增仪（Perkin Elmer公司，美国）；ABI7000荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；电泳仪（美国Bio-Band公司）；高速离心机（CS-15R，美国Beckman）；AIRTECH超净台（苏净集团安泰公司）。实验方法1、动物模型制作和行为学观察同论文一。2、动物分组同第一部分。3、Trizol法提取大鼠脊髓组织总RNA，RNA浓度和纯度鉴定；cDNA合成。4、TNFα、IL-1β、IL-6引物和荧光探针设计、合成及荧光定量RT-PCR方法检测TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表达变化和PTX对其影响。5、统计学方法计量资料以均数±标准差表示，运用SPSS13.0统计软件包进行分析。组间比较采用方差分析，先行方差齐性检验。以P<0.05为有统计学差异。实验结果1、内参基因GAPDH和目的基因TNFα、IL-1β、IL-6的标准品Ct值与起始模板数之间呈良好线性关系，相关系数分别为0.986，0.996，0.997，0.993，证实了用Ct值进行定量的准确性。结果显示在循环早期就可检测到看家基因GAPDH的高表达，并且在任一时间点各组间GAPDH的表达都没有差异（P>0.05）。2、PTX对脊髓TNFαmRNA表达的影响与术前相比较，CCI组TNFαmRNA起始模板量于术后1天开始升高，并且高于Sham组（P<0.05）；14天时下降，21天时基本回到基础水平（P>0.05）。与CCI组比较，PTX组TNFαmRNA起始模板量明显降低（P<0.05），术后1天时为CCI组的53％，术后7天时为CCI组的65％（P<0.05），但仍高于Sham组（P<0.05）。3、PTX对脊髓IL-1βmRNA表达的影响与术前比较，CCI组IL-1βmRNA起始模板量于术后1天时为术前的4.4倍，并且高于Sham组（P<0.05）；术后7天进一步升高，为术前的5.7倍（P<0.05）；术后14天开始下降，但仍高于Sham组（P<0.05）。术后21天时三组间比较无显著差异（P>0.05）。与CCI组比较，PTX组IL-1βmRNA起始模板量明显降低（P<0.05），但仍高于Sham组（P<0.05）。4、PTX对脊髓IL-6mRNA表达的影响与术前比较，CCI组IL-6 mRNA起始模板量于术后1天，7天，14天，21天时分别为术前的3.1，5.1，6.2和5.5倍（P<0.05），各时间点均高于Sham组（P<0.05）；与CCI组比较，PTX组IL-6 mRNA起始模板量明显降低（P<0.05），术后1天，7天，14天，21天时分别为CCI组的62％，60％，55％和56％（P<0.05），但仍高于Sham组（P<0.05）。结论1、成功复制CCI神经病理性疼痛动物模型，在此模型上观察到明显的机械性和热痛觉过敏。2、预先系统给予已酮可可碱可显著抑制CCI大鼠的机械性和热痛觉过敏行为。3、PTX的镇痛作用可能与其抑制外周神经损伤后脊髓中促炎性细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6表达上调有关。4、脊髓TNFα、IL-1α和IL-6在神经病理性疼痛中的表达时程不同，前两者更多参与神经病理性疼痛起始过程，后者更多参与病理性疼痛的维持。