背景及目的:强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一种以慢性炎症性反应为特征的慢性自身免疫性疾病,以炎症性腰背疼痛为主要表现,通常隐匿性起病。AS致残率很高,病人在长期遭受背痛、腰痛、关节痛的折磨,人体的中轴骨和四肢关节结构遭受到进行性破坏,最终出现关节骨性僵直,进而导致颈部、腰部和下肢行动能力的减弱,甚至完全丧失活动能力,使患者承受巨大心理负担和经济压力。因此,研究AS的发病机制对疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。目前AS的发病机制尚不明确,广泛认为是由基因、环境以及表观遗传等多种因素共同导致的慢性疾病。既往研究证明了AS具有家族聚集性,因此,我们选取了一个AS家系来研究其遗传易感基因和肠道菌群的的特点,期待找到新的AS的易感基因和微生物标志物,同时,研究了HDAC4在AS中的表观遗传作用,最终可以指导AS的早期诊断以及生物靶向治疗。方法:1.WES测序和HLA-B27分型检测:1)研究纳入了一个拥有四代成员的中国汉族AS家系。所有联系到的家庭成员都被邀请参加这项研究（共19名家系成员）。所有AS患者根据国际脊椎炎评估协会（Assessment of Spondylo Arthritis international Society,ASAS）的标准诊断。招募了24名无血缘关系的AS患者作为疾病对照组,20名无血缘关系或自身免疫性疾病的种族匹配的受试者作为健康对照组（healthy controls,HCs）。2)采用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（Fast Pure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit）对采集的血样进行基因组DNA的提取。3)对7名家系的AS患者的DNA进行全外显子基因组测序（Whole Exome Genome Sequencing,WES）,筛选AS的易感基因。4)对19名AS成员、24名疾病对照受试者和20名健康对照受试者的DNA进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）测序验证易感基因。5)对19名AS成员、24名疾病对照受试者和20名健康对照受试者的DNA进行HLA-B27分型检测。6)数据分析。2.16S r RNA测序:1)研究纳入了一个拥有四代成员的中国汉族AS家系。共14名家系成员都被邀请参加这项研究。AS患者根据ASAS的标准诊断。分别收集每一名家系成员的粪便样本和唾液样本,分为粪便-疾病组（faeces-patients,F-Ps）、粪便-对照组（faeces-controls,F-Cs）、唾液-疾病组（saliva-patients,S-Ps）、唾液-对照组（saliva-controls,S-Cs）。同时招募了34名无血缘关系的AS患者（AS组）以及30名年龄性别匹配的健康受试者作为健康对照组（healthy controls,HCs）。2)对采集的粪便样本和唾液样本,进行总DNA提取,同时采用Nanodrop对DNA进行定量,并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。3)根据序列中的保守区域设计相应引物,并添加样本特异性Barcode序列,进而对r RNA基因可变区（单个或连续的多个）或特定基因片段进行PCR扩增。4)采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。5)使用Mi Seq测序仪进行双端测序,相应试剂为Mi Seq Reagent Kit V3（600cycles）。6)数据分析。3.血液HDAC4变化与TNF-α抑制剂的应答相关:1)研究纳入了在2019年5月至2021年7月期间,就诊于吉林大学第一医院风湿免疫科的132名AS活动期的患者,同时招募了30名OA患者为疾病对照组（disease controls,DC）,30名健康受试者作为健康对照组（healthy controls,HCs）。2)收集强直性脊柱炎患者入院后的临床资料和血液样本,了解其临床特点。采集AS患者W0（治疗前）、W4（治疗后4周）、W8（治疗后8周）和1W12（治疗后12周）的外周血。分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）和血清标本。全部受试者采集W0的外周血样本,然后分离血清和PBMC样本。3)收集所有受试者的PBMC,用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测HDAC4的表达。4)流式细胞仪检测患者新鲜外周血中辅助性T细胞1（T-helper 1,Th1）和辅助性T细胞17（T-helper 17,Th17）的百分率。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测全部患者血清中的促炎症因子[例如,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6]、Th1细胞分泌的细胞因子[干扰素-γ（[interferon-gamma,IFN-γ）]、Th17细胞分泌的细胞因子（IL-17A）水平。5)54例强直性脊柱炎患者接受TNFi治疗,在W4、W8和W12,根据ASAS40反应标准评估治疗反应。6)统计分析。结果:（一）WES测序和HLA-B27分型检测:1.从WES的6名患者（Ⅲ-1、Ⅲ-3、Ⅳ-1、Ⅳ-3、Ⅱ-6、Ⅲ-19）和Ⅱ-1中共生成了246846个SNP和40211个插入缺失序列。2.在千人基因组数据（1000gall）、NHLBI ESP6500数据（esp6500siv2all）、gnom AD数据（gnom ADALL和gnom ADEAS）和Novgene的中华外显子组数据库。保留了外显子或剪接位点（剪接,约10bp）的变异。筛选出优先级为H（High）的致病突变。此外,我们排除了同义突变和SIFT和Poly Phen-2突变为低致病性的预测功能。根据美国医学遗传学会（ACMG）指南类别过滤良性和可能良性的变体。最终获得了三个候选基因（4个SNP,基因名称为ZBTB22,IP6K3,KCNK5）。3.ZBTB22变异在AS家族病例的频率为36.1%,而在健康对照中为0%（P＜0.001）。同样,IP6K3变异在AS家族病例中的频率为36.1%,而在健康对照中为0%（P＜0.001）。4.家系中全部患者为HLA-B27阳性,50%的HCs HLA-B27也呈阳性,并且全部分型为同一种类型,即HLA-B2704型。而非家系HCs的全部HLA-B27为阴性。（二）16S rRNA测序:1.家系样本在科分类水平上,粪便样本和唾液样本的物种差异比较明显。在粪便样本菌群分布中,拟杆菌（bacteroidaceae）为优势菌种,在唾液样本菌群分布中,链球菌（streptoidaceae）则为优势菌种。家系样本中,F-Ps组的双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）丰度明显高于另外三组,而卟啉单胞菌科（porphyromonadacee）的丰度表现出略低于其他三组。非家系的粪便样本中,物种分布差异不明显,而AS组的肠杆菌（enterobacterianceae）物种丰度明显高于HCs组。2.家系样本中6个多样性指数（Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和Coverage）均无显著性差异。一种可能的原因是,同一家族的成员基因遗传性、生活习惯比较相近,导致菌群物种多样性差异不明显;也可能是家系的病例数略少,尚不能够区分较少的组间差异。而在非家系样本中,除外Coverage指数,其余5个多样性指数均发现明显差异（P＜0.05）。3.家系样本在纲水平上,腹泻和GN05呈正相关（P＜0.05）,其余物种和环境因子之间未发现明显相关性。而在科水平上,合养单胞菌科（Syntrophomonadaceae）和CT显示的炎性关节炎等级具有负相关（P＜0.05）,乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）和腹泻有强正相关（P＜0.01）,普氏菌科（Prevotellaceae）与红螺菌科（Rhodospirillaceae）和HLA-B27都呈现正相关（P＜0.05）,韦荣菌科（Veillonellaceae）和吸烟史为强负相关（P＜0.01）。蕨科（Thermaceae）和炎性背痛为正相关（P＜0.05）。（三）血液HDAC4变化与TNF-α抑制剂的应答相关:1.HDAC4与TNF呈强负相关性（rs=-0.370,P＜0.001）,与IL-1β呈弱负相关性（rs=-0.260,P=0.003）。然而AS患者HDAC4与IL-6无相关性（rs=0.134,P=0.125）。2.HDAC4与Th1细胞（rs=-0.190,P=0.118）及其分泌的细胞因子IFN-γ（rs=-0.138,P=0.115）无相关性,而AS患者与Th17细胞（rs=0.316,P=0.008）及其分泌的细胞因子IL-17A（rs=-0.276,P=0.001）呈负相关性。3.与接受NSAID治疗的患者相比,接受TNFi治疗的患者在W8（P=0.026）和W12（P=0.032）达到ASAS40应答的比例更高,但在W4（P=0.397）时二者比例相似。在所有AS患者中,有应答的患者在W8（P=0.014）和W12（P=0.006）的HDAC4高于无应答的患者。治疗后有应答的患者与无应答的患者相比,在W12的HDAC4表达值升高（P=0.016）。结论:1.ZBTB22（6-33283022和rs142582527）两个位点和IP6K3（rs199838681）可能导致AS的三种罕见变体。2.AS患者的肠道微生物组和健康对照组之间存在显著差异,AS患者肠道微生物群落丰富度下降;放线菌（actinobacteria）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、肠杆菌（enterobacterianceae）在AS患者中呈现优势菌种,可能与AS的发生有关;部分环境因子通常也和AS发病相关,并且和微生物群失调之间存在一定的相关性。3.AS患者中的HDAC4表达水平与促炎细胞因子（TNF、IL-1β、IL-17A）、Th17细胞呈负相关性;TNFi治疗后,AS患者中的HDAC4表达水平升高;HDAC4负性调节na（?）ve CD4+T细胞向Th17的极化,但不调节Th1或Th2细胞的极化。