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目的:1.亚硫酸氢盐处理后测序(BSP)技术检测绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化情况,探索基因甲基化对成骨细胞增殖和分化影响及其分子机制;2.探索ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞增殖和分化影响;3.探索补肾中药有效成分牛膝甾酮对ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响及其对成骨细胞作用机制。方法:1.ER α基因甲基化对骨质疏松的影响收集2017年6月份～2018年12月份研究对象血液样本43例,包括14例女性健康人群血液样本,14例绝经后骨质疏松人群和15例绝经后非骨质疏松人群血液样本,BSP测序检测患者ESR1(雌激素受体alpha,ER alpha)甲基化频率,RT-qPCR技术验证ESR1 mRNA表达水平。ELISA检测患者血清中雌二醇和ESR1含量变化。2.体外验证ER α DNA甲基化对成骨分化影响体外培养小鼠成骨细胞MC3T3E1-colon24(MC3T3E1-24),设计合成特异性DNMT1 siRNA干预成骨细胞DNMT1表达和DNA甲基化,RT-qPCR和Western blot技术检测目标基因ER α,p-ER α,成骨分化指标OPG和RANKL,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞分化影响,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因甲基化对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞增殖影响。3.ER α调节AMPK α和Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性为验证ER α对AMPK α的调节作用,运用在线网站PROMO和GPMiner预测ER α作为转录因子在AMPK α基因的结合位点。进一步验证ER α对成骨细胞活性的调节作用和分子机制,构建合成ESR1 shRNA和过表达慢病毒载体,无处理的和阴性慢病毒载体干预的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR 和 Western blot 技术检测ER α,AMPK α 1/2,p-AMPK α 1/2,检测Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG,以及ALP表达变化,ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。4.AMPK α介导Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性上一步验证了 ER α调节AMPK α表达和活化影响成骨细胞活性,为进一步验证AMPK α对成骨细胞调节作用和机制,本研究用AMPK激动剂AICAR处理体外小鼠成骨细胞,无药物处理的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR和Western blot技术检测 AMPK α,p-AMPK α,检测 Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。5.牛膝甾酮介导ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性牛膝甾酮(10 ng/μL)干预 MC3T3E1-24 细胞 48h,RT-qPCR 技术检测 ER α、AMPKα,frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录水平变化,探索牛膝甾酮对ER-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响;RT-qPCR检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测观察成骨细胞钙化情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞分化的促进作用,MTT技术检测成骨细胞活性情况,流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞增殖影响。结果:1.ERα DNA甲基化诱导骨质疏松临床血液样本进行BSP测序,结果发现绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化频率较健康人(P<0.01)和绝经后非骨质疏松人群(P<0.01)高,差异有统计学意义。另外,RT-qPCR检测发现与健康人(P<0.05)和绝经后非骨质疏松人群(P<0.01)相比较,绝经后骨质疏松患者血液样本中ERα转录水平显著增高,然而ELISA检测血清样本中雌二醇(E2)(P<0.01)和ER α(P<0.05)表达降低,差异有统计学意义。2.抑制体外成骨细胞DNA甲基化水平可促进成骨分化绝经后骨质疏松与ERα DNA高甲基化水平相关,其可能通过抑制ER α蛋白表达导致患者骨量减少。体外培养MC3T3E1-24细胞,并通过DNMT1 siRNA干预细胞DNA甲基化水平,结果发现抑制DNA甲基化水平,可促进OPG和ALP的mRNA和蛋白表达,抑制RANKL表达。茜素红染色结果表明,与对照组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞钙化水平显著较高(P<0.05)。MTT结果显示,与空白对照组和阴性siRNA干预组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞活性较强(P<0.05)。3.ER α磷酸化介导AMPK和Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进成骨细胞分化和增殖1)ER α与AMPK转录结合位点预测ER α作为转录因子,可调控靶基因转录激活和转录表达水平。PROMO和GPMiner在线网站预测结果发现,ER α在编码AMPK α的基因PRKAA2的启动区域有结合位点。2)ER α磷酸化对AMPK和Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。ERα shRNA慢病毒载体抑制MC3T3E1-24细胞中ER α转录水平和蛋白表达。另外,RT-qPCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α和p-AMPK α水平降低,差异有统计学意义;Wnt/β-catenin信号通路中,frizzled,GSK 3β,LRP5,β-catenin表达降低;与此同时,骨形成指标OPG和ALP表达降低;ALP活性检测结果进一步显示与对照组比较,ERα低表达组的成骨细胞钙化水平降低,差异有统计学意义,MTT结果展示成骨细胞活性也显著降低。3)ERα过表达慢病毒载体促进MC3T3E1-24细胞中ER α蛋白表达和磷酸化,RT-q PCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α 1/2水平提高,差异有统计学意义;frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录表达显著增多,Wnt/β-catenin信号通路被激活;检测成骨指标发现,OPG和ALP表达与对照组比较显著增多,差异有统计学意义,ALP活性检测和MTT检测结果进一步表明,ER α高表达组的成骨细胞钙化和增殖水平显著增高。4)AMPK对Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。AICAR激活AMPK通路后,MC3T3E1细胞中AMPK转录表达提高,蛋白活化水平也增多,RT-qPCR和WB结果也表明,Wnt/β-catenin信号通路中frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达显著增多,phspho-β-catenin表达降低;OPG和ALP表达也显著增多;ALP活性检测和MTT检测结果表明,与对照组比较,AMPK过表达组成骨细胞钙化和增殖水平增多,差异有统计学意义。4.牛膝甾酮发挥促进ER α磷酸化作用,激活AMPK和Wnt/β-catenin信号通路,从而促进成骨细胞分化和增殖牛膝甾酮孵育48h后,RT-qPCR和WB检测MC3T3E1-24细胞中ER α-AMPK-Wnt/β-cat enin信号通路相关基因表达,结果发现,ER α,p-ER α,AMPK α,p-AMPK α,frizzl ed,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达与无药物处理组比较均显著增多,表明ER α-AMP K-Wnt/β-catenin信号通路被激活,OPG和ALP表达也显著增多,组间差异有意义,表明成骨细胞分化能力增强,茜素红染色和ALP活性检测结果表明,牛膝甾酮促进骨细胞钙化水平,TUNEL检测细胞凋亡情况和MTT检测细胞增殖,结果发现与对照组比较,牛膝甾酮组细胞凋亡和增殖率均无显著差异。结论:1.ER α基因高甲基化促进骨质疏松的发生;2.ERα低表达抑制OPG和ALP表达,促进RANKL表达,成骨分化受到抑制,成骨细胞活性降低;3.ER α激活后促进AMPK α活化,上调Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达,从而促进成骨细胞分化和增殖;4.牛膝甾酮通过激活ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化发挥促进骨形成作用。