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卵泡闭锁(Follicular atresia)主要是由卵巢颗粒细胞凋亡引起,卵巢颗粒细胞凋亡是影响卵泡闭锁的重要因素。Bmi1基因属于Polycomb家族成员之一,是一种原癌基因。先前研究结果证实Bmi1基因缺失会导致雌性小鼠完全不孕,闭锁卵泡增加,卵巢组织中p53基因及蛋白表达水平上调,氧化应激增加。然而,Bmi1基因缺失诱导卵泡闭锁的机制目前尚不清楚。为明确Bmi1基因缺失是否通过激活p53信号通路,增加氧化应激和DNA损伤,抑制颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞衰老及凋亡,从而引起卵泡闭锁,最终导致雌性不孕,我们建立了 Bmi1基因缺失及p53基因半剂量缺失小鼠模型(Bmi1-/-p53+/-),利用形态学、组织病理学以及分子生物学等方法比较分析野生型雌鼠(WT)、p53基因敲除杂合子雌鼠(p53+/-)、Bmi1基因敲除雌鼠(Bmi1-/-)与Bmi1-/-p53+/-雌鼠卵巢的表型差异。我们的结果显示:与WT雌鼠相比,7周龄Bmi1-/-雌鼠卵巢体积变小,重量明显降低,卵巢/体重比下降;Bmi1-/-雌鼠卵巢各级卵泡都出现闭锁且数量明显增多,卵巢颗粒细胞增殖减少,凋亡增加;DNA损伤指标磷酸化组蛋白(γH2A.X)和p53结合蛋白1(53bp1)以及衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)阳性细胞百分率均显著增加;抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD2)、谷胱甘肽还原酶(GSR)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)以及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)等基因的mRNA表达水平显著下调;p53信号通路相关基因的mRNA水平以及蛋白表达水平均明显上调。7周龄p53+/-雌鼠卵巢体积变大,重量增加,卵巢/体重比有所增加,除SOD2以外抗氧化酶基因mRNA表达水平上调。与Bmi1-/-雌鼠相比,7周龄Bmi1-/-p53+/-雌鼠PCNA阳性细胞百分率以及抗氧化酶基因表达水平显著增加,p53信号通路相关基因以及蛋白表达水平均明显下调但未达到WT雌鼠水平。为明确Bmi1缺失引起的卵泡闭锁是否也与卵母细胞成熟障碍有关,我们对3周龄WT雌鼠以及Bmi1-/-雌鼠进行超排卵实验,结果显示:与WT雌鼠相比,Bmi1-/-雌鼠卵丘卵母细胞复合体(COC)及MⅡ期卵母细胞数量明显减少,且卵母细胞生长分化因子(GDF9)mRNA表达水平显著下调。这些在体结果表明p53基因杂合敲除能通过抑制氧化应激和DNA损伤,抑制卵巢颗粒细胞衰老和凋亡,促进卵巢颗粒细胞增殖和卵母细胞成熟,从而部分纠正Bmi1缺失引起的卵巢发育障碍以及卵泡闭锁。通过体外培养7周龄WT雌鼠和Bmi1-/-雌鼠颗粒细胞,我们发现:与WT雌鼠颗粒细胞相比,Bmi1-/-雌鼠颗粒细胞增殖阻滞,p19、p53、p21基因表达水平明显上调,抗氧化酶GPX1、GSR、CAT基因表达水平明显下调。为进一步明确Bmi1缺失是否通过激活颗粒细胞p53信号通路或增加细胞氧化应激水平,引发颗粒细胞衰老凋亡增加,进而导致卵泡闭锁,我们在体外分别给予7周龄Bmi1-/-雌鼠颗粒细胞30μMPFTα(p53抑制剂)以及1mMNAC(抗氧化剂)处理,利用细胞生物学方法比较分析了各组细胞的表型差异。结果显示:与WT组颗粒细胞相比,Bmi1-/-组颗粒细胞ROS水平、TUNEL阳性率、SA-β-Gal染色阳性面积以及p16 mRNA水平明显增加,而PFTα(30μM)或NAC(1mM)处理能够降低Bmi1-/-颗粒细胞的ROS水平、凋亡和衰老。与NAC处理相比,PFTα处理使颗粒细胞凋亡降低更加明显。这些结果提示Bmi1缺失通过激活p53信号通路和增加氧化应激而发挥抑制颗粒细胞增殖,诱导颗粒细胞凋亡和衰老的作用。本研究结果证明了 Bmi1基因缺失能够通过激活p53信号通路,增加氧化应激和DNA损伤,抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞衰老和凋亡,抑制卵母细胞成熟,诱导卵泡闭锁而导致雌性不孕。本研究揭示Bmi1基因在维持女性生殖功能中起有重要作用,为临床女性不孕、卵巢早衰等相关生殖疾病防治的临床研究提供了新的分子靶标。