原发性肝癌是全球发病率很高的恶性肿瘤之一,目前据世界卫生组织统计,全世界每年新发现病例超过26万人,肝癌的发病率和死亡率均占我国癌症中的第三位。肝癌的发生经过多个环节调控,由启动、促癌和发展等多个步骤形成,涉及多个基因参与和突变,最终导致肝细胞由不典型增生直到肝细胞癌变,病因并不完全清楚。目前大部分研究认为肝细胞癌的发生与肝硬化结节、乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、基因变异和地理环境因素密切相关。由于原发性肝癌经血及淋巴液转移早,局部侵润性强,多数确诊时已经发展到了中晚期,预后较差。绝大多数肝癌患者在明确诊断时往往已进入中、晚期,癌细胞已经在肝脏内外发生广泛的转移,虽然手术、介入、化疗及放疗等传统治疗手段在肝癌治疗方面取得一些重大进展,但肝癌患者的近期生存率和远期预后没有明显改善,因此,寻找新的治疗方法成为了临床医生和科研工作者最关注的问题。目前除了医院常用的传统手术、化疗和放射治疗之外,随着基因工程技术的日益成熟,许多医院逐渐开展了各种各样的基因介导治疗,这些基因治疗技术包括自杀基因治疗、免疫基因治疗、导入抑癌基因治疗、抗肿瘤血管基因治疗等等,其中以腺病毒介导抗肿瘤血管基因治疗方法已经成为目前的研究热点之一。早在二十世纪七十年代,Folkman首次提出了恶性肿瘤生长依赖于新生血管的形成,新生血管供给恶性肿瘤生长所需的营养,这种观点随后被大量研究证实。当肿瘤直径达到1mm时,如果没有新生血管支持其生长,肿瘤便进入休眠期或退化,如果新生的血管长入肿瘤组织,肿瘤将会快速生长达到失去控制的体积。新血管提供给肿瘤氧和各种营养并带走代谢废物。因此,抗肿瘤血管生成治疗可以直接切断肿瘤生长转移所依赖的营养供给,此种方法现在已成为肝癌研究领域新亮点。近年研究表明新生血管形成仅在少数组织中存在,除了女性生殖子宫内膜、胎盘组织和伤口修复等部位发生短暂的新生血管的现象,体内的血管系统大部分时间是保持静止状态的,体内的部分组织中血管是否发生主要取决于局部促血管发生因子和血管抑制因子之间的平衡状态。一方面促血管生长因子的上调促进血管生成,另一方面血管生长抑制因子水平的下调抑制血管生成。目前研究证明所有内源性血管生长抑制因子都能够抑制动物模型体内的肿瘤生长,但是直接应用血管生成抑制因子治疗恶性肿瘤目前仍面临许多问题：1)需要长期应用血管生成抑制因子；2)当大剂量应用可能会对人体产生有害的免疫反应。3)生产成本高导致巨额治疗费用使病人难易承担。基因治疗是通过生物载体或非生物技术将目的DNA或RNA转移到宿主细胞中使其能够有效的进行表达,即在宿主细胞内合成重组蛋白,作用于局部组织而发挥抗肿瘤的治疗作用。这种基因治疗的优点是：1)借助外源基因的导入,使宿主细胞本身可以合成重组蛋白,从而减少了生产成本；2)基因治疗是将目的基因导入肿瘤细胞内,使其能够有效表达,在肿瘤局部区域重组蛋白含量增多,明显提高治疗效果。如今,全世界正在进行的二百多个临床基因治疗试验项目中约有半数是针对于恶性肿瘤治疗的,而这其中又有一半的基因疗法又都是针对肿瘤细胞本身。目前应用抑制血管生成的基因治疗直接针对血管内皮细胞,因为血管内皮细胞遗传性十分稳定,目的基因可以在人体内稳定地表达数月或数年,并且这种基因治疗载体要比制造大量高纯度的蛋白质容易和减少许多花费。目前,腺病毒作为基因治疗中常用的载体工具,具有外源基因表达高效及转染率高等优点,重组腺病毒在局部肿瘤组织中大量表达重组蛋白,在局部抑制肿瘤血管的生成,同时腺病毒感染肿瘤细胞还能诱发宿主抗肿瘤免疫反应,可以从多种方面发挥抗肿瘤作用。近年,研究者发现了一种新的内源性血管生成抑制因子——canstatin蛋白,canstatin蛋白源于Ⅳ型胶原a2链C端非胶原区(NC1)结构域,对内皮细胞的增殖和迁移具有明显的抑制性作用,可诱导内皮细胞调亡,从而发挥抑制新生血管形成及其生长的作用。研究显示,canstatin蛋白可以明显抑制裸鼠人肾癌、前列腺癌、食管癌及卵巢癌的生长,但是canstatin蛋白对肝癌的抑制作用如何,由腺病毒介导的canstatin基因对人肝癌的治疗作用如何?这些问题目前国内外尚未见报道。在本研究中我们首先克隆了人canstatin基因,并构建了其原核表达载体和重组canstatin蛋白,继而证实了canstatin蛋白抑制肝癌生长的作用,然后我们又构建了携带canstatin基因的腺病毒载体,最后将携带canstatin基因的重组腺病毒注入小鼠肝癌移植瘤中,观察小鼠肝癌移植瘤体积变化、病理变化、微血管密度和肝癌组织中caspase-3及Flk-1达,探讨其在肝癌治疗中的作用。第一部分实验人canstatin cDNA基因的克隆目的：克隆人canstatin cDNA基因,分析其基因序列。方法：采用RT-PCR技术,从新鲜人胎盘组织中提取目的基因canstatin cDNA,进而克隆载体pGEM-T,然后获得重组质粒pGEM-T/canstatin,最后转化E.coliDH 5a,筛出阳性克隆基因,测定其序列。结果：1%琼脂糖凝胶电泳显示,人胎盘组织中mRNA有3条清晰条带(5S,18S,28S)；分光光度计测定显示,mRNA的A260=0.878, A280=0.411, A260/A280=2.136,计算总RNA浓度为1.76g/L。RT-PCR扩增物与目的基因canstatin长度基本一致。RT-PCR扩增产物与载体PGEM-T连接处理后,转化E.coli DH5a,可在有氨苄青霉素的LB平板上见到白色和蓝色菌落,挑选相对较好5个白色菌落做Bam HI和HindⅢ酶切鉴定,证实为阳性克隆。上海生物工程公司测定基因序列显示,重组质粒阳性克隆中的目的基因与GenBank公布的canstatin基因序列相同。结论：我们成功克隆了canstatin基因,为下一步利用canstatin蛋白抗肝癌治疗研究奠定了基础。第二部分实验原核表达并重组人canstatin蛋白目的：构建canstatin基因原核表达载体,表达并纯化重组人canstatin蛋白。方法：使用双酶切从重组质粒pGEM-T/canstatin上切下canstatin基因,插入到目的质粒pET-22b(+)相应位点,转化E.coli BL21,经过IPTG诱导重组人canstatin蛋白表达,使用SDS-PAGE电泳仪分析人canstatin蛋白表达情况。采用Ni-NTA柱亲和层析并纯化重组人canstatin蛋白,使用PBS对其透析复性。结果：从重组质粒PGEMT-T/canstatin切下目的基因canstatin cDNA,插入到质粒pET-22b(+)相应位点,转化E. coliBL21,挑选5个较好的菌落经Bam HI和HindⅢ双酶切后做电泳鉴定,显示所有菌落均含有2条特异性条带,分别与目的基因及原质粒对应。SDS-PAGE电泳仪分析结果显示在24KD出现新蛋白条带,诱导后1h、2h、3h和4h表达蛋白占菌体总蛋白的比例分别为17.2%,17.8%,21.0%和22.4%。Ni-NTA柱亲和层析显示,在125Mm和250mM洗脱液中均纯化出人canstatin蛋白.结论：canstatin原核表达载体可以被成功构建,并纯化出重组人canstatin蛋白。第三部分实验探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效目的：探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效。方法：利用SMMC-7721肝癌细胞株建立30只裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,当肿瘤长至直径2-3mm时,随机分3组,即PBS对照组,5-Fu治疗组和canstatin蛋白治疗组,各组均经瘤体内多点注射给药。治疗期间定期测量移植瘤大小及重量；治疗后取出瘤体做常规病理检查免疫组化染色,总疗程为21天。结果：从治疗第3天,canstatin治疗组及5-Fu治疗组移植瘤体积显著小于对照组(P<0.05)；治疗第6天,有非常显著差异P<0.01。疗程结束时,虽然5-Fu治疗组疗效最显著,但全身的毒副作用明显,病理证实肝脏损害严重。结论：重组人canstatin蛋白可显著抑制肝癌组织生长,没有明显毒副作用,是肝癌患者较为理想的治疗方法。第四部分实验构建携带canstatin基因的腺病毒载体目的：利用基因工程技术,构建携带canstatin基因的腺病毒载体Ad-canstatin.方法；使用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增PET/canstatin载体上canstatin基因,双酶切后插入到pCA13质粒相应的位点,成功构建pCA13-Cans穿梭载体；pCA13-Cans与腺病毒骨架pBGHE3共转染293细胞,经3次病毒空斑纯化得到重组腺病毒,利用聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定重组腺病毒。经293细胞扩增重组腺病毒、采用氯化铯密度梯度法离心纯化重组腺病毒并使用TCH150检测重组腺病毒的滴度。结果：从PET/canstatin载体上成功扩增出709bp含canstatin基因的DNA片段,将其插入到pCAl3质粒中成功构建了pCA13-Cans质粒,并经PCR及酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架pBGHE3在293细胞内同源重组获得重组腺病毒,再经PCR鉴定重组腺病毒构建正确,命名为Ad-canstatin,使用TCH150检测重组病毒的滴度为3.1×109pfu/ml。结论：获得了高滴度重组腺病毒Ad-canstatin为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。第五部分实验Ad-Canstatin治疗肝癌实验研究目的：观察Ad-Canstatin在小鼠肝癌瘤体内抑制肝癌疗效。方法：以SMMC-7721人肝癌瘤细胞建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。首先培养人肝癌瘤细胞悬液,将24只裸鼠随机均分成3组,每只裸鼠左侧腋窝皮下注射瘤细胞悬液0.1ml(浓度为2×107/ml),等到裸鼠肿瘤体积生长至50mm3左右时,将荷瘤裸鼠随机平均分成Ad-canstatin治疗组、PBS对照组和GFP空载组,每组有8只荷瘤裸鼠。每个肿瘤均行两次瘤内注射,间隔72小时,Ad-canstatin组和GFP空载组裸鼠瘤内注射病毒量分别为为8×109PFU,PBS对照组裸鼠注射0.1ml PBS。主要观察指标有：1、肿瘤生长抑制率2、肿瘤体积生长曲线。3、病理学检查：在注射药物30天后裸鼠均被处死,比较各组组织病理学变化。4、免疫组织化学方法检查：检测各组的肿瘤组织中caspase-3和Flk-1表达情况。结果：1.在注射Ad-canstatin基因治疗后第3天,Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤体积明显小于PBS和GFP组(P<0.05)；其后观察发现,随着时间延长各组裸鼠肿瘤体积均增大,但Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤生长速度和肿瘤体积均显著小于PBS和GFP组(P<0.05)。2.病理学检测显示,各组裸鼠瘤体内均见有不同程度的坏死组织,Ad-canstatin治疗组裸鼠瘤体内的坏死组织显著多于PBS和GFP组。3.Ad-Canstatin治疗组Flk-1的表达明显低于PBS组和GFP组,差别有统计学意义(x2=7.778,p<0.01)；4.Ad-canstatin治疗组caspase-3的表达明显高于GFP组和PBS组,差别有统计学意义(分别x2=6.563和x2=10.50,p<0.01)。结论：利用腺病毒载体Ad-Canstatin能够成功抑制裸鼠肝癌组织的生长,并能够降低肝癌组织中Flk-1的表达和提高caspase-3的表达。我们认为Ad-canstatin治疗肝癌的作用机制是：一方面在肿瘤组织中表达canstatin蛋白从而抑制肝癌血管的生成,另一方面,可能是降低Flk-1的表达和提高肝癌组织caspase-3的表达,促进了肝癌细胞的凋亡,从而也起到抑制肝癌细胞的生长。总之,canstatin蛋白作为新的内源性血管生成抑制剂有望成为治疗肝癌的新药物,利用腺病毒介导canstatin基因治疗肝癌不但能发挥强大的抗肿瘤作用而且能减少治疗费用,为肝癌治疗开辟了新方法,未来将会有良好的应用前景。