本试验以30日龄左右的胎猪为试验材料，根据NCBI上公布的野猪Sox2、Nanog基因序列，设计合成上、下游引物并导入相应的酶切位点，Sox2的引物中导入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，Nanog的引物中导入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点；从胎猪生殖嵴部位提取总RNA，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增猪Sox2、Nanog基因，经限制性内切酶酶切，与PLEGFP-N1连接重组为过渡载体PLEGFP-Sox2、PLEGFP-Nanog；抽提纯化后PCR扩增EGFP-Sox2、EGFP-Nanog与改造的慢病毒载体pLentiLox3.7构建重组质粒PLL-Sox2、PLL-Nanog，并且通过脂质体介导将重组质粒PLL-Sox2、PLL-Nanog转染293细胞，在转染24h后，观察Sox2、Nanog融合绿色荧光蛋白在293细胞中的表达情况，试验结果：　　 （1）克隆出序列正确的猪Sox2、Nanog基因。经RT-PCR反应扩增出片段核苷酸序列长度约为957bp的猪Sox2和核苷酸序列长度为913bp的猪Nanog，对扩增出的猪Sox2和Nanog连接到T载体上，对Sox2和Nanog的T载体阳性菌测序结果显示猪Sox2的957bp核苷酸序列中有5个碱基同野猪的核苷酸存在差异：第224个碱基G→A、第447个碱基C→T、第511个碱基T→G、第594个碱基C→A、第712个碱基A→G，同源性达99.5％。由于密码子的简并性，相应的有三个氨基酸发生改变：75位精氨酸→赖氨酸、149位精氨酸→色氨酸、171位半胱氨酸→甘氨酸。猪Nanog的913bp核苷酸序列中也有7个碱基同野猪的核苷酸存在差异：第124个碱基T→G、第258个碱基G→C、第540个碱基C→T、第602个碱基G→A、第610个碱基A→T、第612个碱基C→A，同源性达99.5％。相应的有四个氨基酸发生改变：42位丝氨酸→丙氨酸、86位谷氨酸→天门冬氨酸、201位丝氨酸→苏氨酸、204位苏氨酸→丝氨酸。　　 （2）成功构建出猪逆转录病毒表达载体PLEGFP-Sox2、PLEGFP-Nanog。连接序列正确的Sox2、Nanog基因到pLEGFP-N1载体，构建PLEGFP-Sox2、PLEGFP-Nanog。PCR鉴定结果经1％琼脂糖凝胶电泳得到了大小约900-1000bp之间的单一条带，Sox2基因大小约957bp，Nanog的片段大小为913bp，均与预期的目的片段相符；构建的重组质粒经酶切得到两条带，大小分别为900bp和7000bp左右，pLEGFP-N1的片段大小为6891bp，与RT-PCR产物和pLEGFP-N1质粒大小相符。这更进一步证明构建出猪逆转录病毒表达载体PLEGFP-Sox2、PLEGFP-Nanog。　　 （3）成功构建出猪慢病毒表达载体PLL-Sox2、PLL-Nanog。重组质粒PLL-Sox2、PLL-Nanog转染293细胞，转染24h后观察EGFP表达情况。在荧光显微镜下可见到293细胞生长状态很好，而且转染PLL-Sox2、PLL-Nanog质粒的293细胞表达EGFP，结果表明已成功构建出融合表达Sox2、Nanog和EGFP报告基因的猪慢病毒表达载体PLL-Sox2、PLL-Nanog，而且脂质体介导的PLL-Sox2、PLL-Nanog质粒可转染293细胞。　　 （4）载体改造成功。通过脂质体介导重组质粒转染293细胞，在荧光显微镜下观察到构建的Sox2和Nanog慢病毒表达载体介导的绿色荧光蛋白为核表达，符合Sox2和Nanog绿色荧光融合蛋白的设计，证实载体改造正确。