阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种渐进性神经退行性疾病，又称老年痴呆症。促进AD发生发展的两个主要致病因素是细胞外β淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）的沉积和细胞内tau蛋白的过度磷酸化。Aβ来源于β淀粉样前体蛋白（amyloid β-protein precursor，APP），APP通过多种蛋白质水解途径进行加工，通过β-和γ-分泌酶作用途径,产生Aβ片段。当各种因素导致Aβ空间构象发生错误折叠转变成以β折叠为主时，就会导致蛋白质聚集，难以被蛋白酶水解，从而在组织内沉积并诱导神经元凋亡甚至坏死。tau蛋白是一种微管结合蛋白，具有促进微管组装并维持神经元微管稳定的作用。目前发现tau蛋白有6种异构体和30多个丝氨酸或苏氨酸磷酸化位点。在AD病理条件下，tau蛋白的这些位点发生异常磷酸化，过度磷酸化的tau进一步聚集并形成神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFTs），使其失去与微管结合的能力，从而引起神经细胞的丢失，最终导致神经退行性变。内质网应激（EndoplasmicReticulum stress, ER Stress）现象存在于AD和帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经退行性疾病和脑缺血等其他神经系统疾病中。在AD发病过程中，各种因素导致Aβ空间构象发生错误折叠,转变成以β折叠为主及磷酸化的tau增多时，导致蛋白质聚集，从而诱发ER应激反应。MANF [MesencephalicAstrocyte-derived Neurotrophic Factor，又名ARMET （Arginine rich, mutated in early stageof tumors）]，是一种在ER应激条件下特异性表达的蛋白质，在多种病理条件下发挥神经保护作用。本课题组前期研究发现，脑缺血可引发局部神经元细胞中ER应激从而诱导MANF基因高表达。在体外神经元细胞培养实验中，ARMET能促进神经元细胞的增殖，抑制ER应激诱导的细胞凋亡，重组MANF蛋白可抑制衣霉素诱导的神经细胞凋亡。目前发现MANF对大鼠帕金森氏病模型有保护作用，而MANF在AD中的相关功能目前尚未见报道。目的：本课题旨在观察MANF是否可以抑制Aβ诱导的神经细胞毒性作用和冈田酸诱导的N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化，以了解MANF神经保护作用的机制。方法：构建MANF基因过表达质粒pCIneo-MANF-FLAG及针对MANF基因的siRNA质粒pLentilox3.7-MANF-siRNA。MANF基因的特异性siRNA序列为：sense：5’-GGA CCU CAA AGA CAG AGA UTT-3’，和antisense：5,-GCAGAU CGA CCU GAG CAC ATT-3’。表达和纯化重组人MANF蛋白。进行原代神经元细胞培养并经NeuN染色鉴定，培养人来源的神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞和小鼠来源的神经母细胞瘤细胞株N2a细胞，用Aβ诱导神经毒性。用PI染色方法检测死亡的细胞，用细胞免疫荧光染色观察Aβ诱导的原代神经元细胞及SH-SY5Y细胞内MANF、Bip/GRP78和Chop的表达。经重组人MANF蛋白处理SH-SY5Y细胞后，或将MANF过表达质粒和siRNA质粒转染N2a细胞后，经Aβ诱导，用MTT检测法观察SH-SY5Y和N2a细胞增殖活性变化，用TUNEL染色检测N2a细胞转染MANF相关质粒后细胞凋亡情况，用免疫印迹法检测N2a细胞转染MANF相关质粒后细胞蛋白的表达量。结果：1．Aβ诱导神经细胞毒性将SH-SY5Y细胞培养至适当密度，用不同浓度的Aβ处理，以空白对照组和无血清试验组作为对照，24hrs后用按照试剂说明书的操作步骤进行PI染色。在普通光镜和荧光显微镜下观察细胞死亡变化。与对照组相比，Aβ处理组，随着Aβ浓度的逐渐增加，细胞死亡的数目量逐渐增多，该结果提示Aβ处理可以诱导神经细胞死亡。2．Aβ诱导神经细胞发生ER应激为了观察Aβ诱导的细胞死亡是否由ER应激介导，我们采用10μM的Aβ处理SH-SY5Y细胞，并用ER应激诱导剂衣霉素（tunicamycin, TM,2.5μg/ml）作为阳性对照，同时检测ER应激的标志性蛋白CHOP/GADD153。结果发现Aβ可促进SH-SY5Y细胞中CHOP的表达。同样，我们用10μM的Aβ处理原代培养的大鼠神经元后，细胞中的BIP/GRP78、CHOP/GADD153表达增加。上述结果提示Aβ诱导的ER应激可能是其细胞毒性的因素之一。3. Aβ上调MANF表达在体外培养的SH-SY5Y细胞和原代培养的大鼠神经元细胞中加入浓度为10μM的Aβ，然后用MANF抗体进行细胞免疫荧光检测。结果发现，Aβ可引起上述两种细胞中MANF的表达明增加。4．MANF对Aβ神经毒性的抑制作用4.1重组人MANF抑制Aβ的神经毒性用不同浓度的重组人MANF蛋白(0.5mg L^-1,1mg L^-1和2mg L^-1)处理SH-SY5Y细胞4hrs，再用Aβ25-35（10μM）处理24hrs，然后用MTT方法检测细胞增殖活性。实验结果显示：重组人MANF蛋白可剂量依赖性抑制Aβ25-35诱导的细胞死亡，且其作用随时间的延长而增加。4.2MANF过表达减弱Aβ的神经毒性在N2a细胞中转染pCIneo-FLAG-MANF，转染24hrs后给予不同浓度的Aβ处理（1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）和经10μM Aβ处理，在不同时间（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）进行MTT检测。结果发现细胞内过表达MANF蛋白可抑制Aβ引起的神经毒性。4.3沉默内源性的MANF增加Aβ诱导的神经毒性在N2a细胞中转染MANF的siRNA以沉默内源性的MANF，在转染24hrs后给予不同浓度的Aβ处理（1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）和经10μMAβ处理，在不同时间（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）进行MTT检测。结果发现，干扰内源性MANF可增强细胞对A毒性的敏感性。5．MANF对Aβ诱导的细胞凋亡的抑制作用在N2a细胞中分别转染pCIneo-FLAG-MANF和pLentiLox3.7-MANF-siRNA质粒及它们的对照质粒，转染24hrs后给予10μM的Aβ处理，然后进行TUNEL染色。结果发现，过表达MANF能抑制Aβ诱导的细胞凋亡，而干扰内源性MANF的表达可促进Aβ诱导的细胞凋亡。同样免疫印迹检测也发现过表达MANF可以降低CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表达，沉默MANF后CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表达增加。以上结果提示，MANF可通过抑制ER应激引起的细胞凋亡而抑制Aβ的神经毒性。6．MANF对tau蛋白过度磷酸化引起的细胞毒性抑制作用6.1OA诱导的tau蛋白过度磷酸化在体外培养的N2a细胞加入25nmol·L^-1OA作用24hrs，然后用tau-5抗体和AT-8抗体分别对细胞内总tau蛋白和磷酸化的tau蛋白水平进行检测。结果发现，OA处理后磷酸化的tau蛋白水平明显增加，而总tau蛋白水平与对照组相比无明显差异，上述结果提示OA能诱导tau蛋白的过度磷酸化。6.2.重组人MANF预处理抑制OA诱导的tau蛋白过度磷酸化及细胞毒作用在N2a细胞中预先加入不同浓度(1、2、4mg·L^-1)重组人MANF蛋白处理4hrs后，再经25nmol·L^-1OA处理24hrs以诱导tau过度磷酸化，收集细胞，并用免疫印迹检测蛋白质的表达水平。用AT-8单克隆抗体检测磷酸化的tau，GAPDH作为加样对照。结果发现，OA可诱导N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化，从而使细胞的增殖活性降低。重组人MANF蛋白(2,4mg·L^-1)预处理N2a细胞均能抑制OA诱导的tau蛋白过度磷酸化，并能显著提高细胞的增殖活性。6.3. MANF的表达水平对OA诱导的tau过度磷酸化及细胞毒的影响在N2a细胞中转染pcDNA3.1vector、pCIneo-MANF-FLAG、pLentilox3.7vector、pLentilox3.7-MANF-siRNA四种质粒，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，转染24hrs后经25nmol L^-1 OA诱导24hrs，收集细胞，蛋白用AT-8和GAPDH单克隆抗体进行检测。结果发现，MANF基因过表达可明显抑制N2a细胞中OA诱导的tau蛋白过度磷酸化，而siRNA下调MANF基因的表达则可促进tau蛋白磷酸化。经MTT检测分析发现，MANF基因过表达明显促进N2a细胞活性，而MANF基因沉默则可促进OA对N2a的毒性作用。结论:Aβ可以引起神经细胞死亡，并可以诱导ER应激和MANF表达；MANF可抑制Aβ诱导的神经毒作用，并可通过抑制tau的过度磷酸化而对神经细胞有保护作用。