【摘 要】
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目的近年来已认识到,在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy DCM）发生过程中心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts CFs）在心肌重构中起到了不可忽视的重要作用,心肌纤维化会导致心肌僵硬、心室重构最终导致心力衰竭。Micro RNAs（miRNAs）是一类非编码单链小RNA,长度约为22个核苷酸,已被证实在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等疾病的病理机制中
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目的近年来已认识到,在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy DCM）发生过程中心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts CFs）在心肌重构中起到了不可忽视的重要作用,心肌纤维化会导致心肌僵硬、心室重构最终导致心力衰竭。Micro RNAs（miRNAs）是一类非编码单链小RNA,长度约为22个核苷酸,已被证实在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等疾病的病理机制中扮演者重要角色。本实验通过探究miRNA-369-5p在糖尿病心肌病中对CFs的作用,从而为治疗糖尿病心肌病提供一个靶点。方法动物模型实验:将40只SD大鼠随机分为正常组和实验组,每组各20只。实验组大鼠高脂高糖饮食4周后腹腔注射65mg/kg链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）1次,正常组饲以普通饮食且等量注射生理盐水。在注射后的第7天,通过大鼠尾静脉取血测血糖,如果血糖高于16.7mmom/L,则认为大鼠造模成功。饲养12周后,将大鼠处死,用眼科剪解剖出大鼠心脏,放入EP管于-80℃冻存用于后续实验。取部分心肌组织进行固定、包埋后行HE、Masson染色观察大鼠心肌组织。通过提取大鼠心脏组织蛋白,我们用Western Blot检测与心肌纤维化有关的蛋白,即α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）及I型胶原蛋白（collagen typeⅠ,CollagenⅠ）的表达。细胞实验:提取乳鼠原代成纤维细胞分别予以高糖、正常糖浓度培养48h后提取细胞总RNA及蛋白用于q RT-PCR和WB实验。用高糖培养基培养CFs至对数期时,Lipofectamine?2000 Reagent试剂瞬时转染阴性对照组和miRNA-369-5P inhibitors于乳鼠CFs中,继续培养24-48h后,提取细胞RNA和蛋白,再行q RT-PCR和WB实验以此观察inhibitors组中的miR-369-5p,α-SMA,CollagenⅠ相对于阴性对照组,正常组表达变化情况。用CCK-8实验检测转染inhibitors后CFs增殖活性表达。结果HE和Masson染色显示糖尿病心肌病大鼠心肌胶原沉积显著增多,细胞相对排列紊乱,细胞大小不一。与正常组相比,糖尿病心肌病心肌组织中miR-369-5p的表达显著降低,而α-SMA与Collagen I的表达显著升高。细胞q RT-PCR实验表明:高糖培养基培养的CFs相对于正常糖培养基的CFs,其miR-369-5p m RNA表达显著降低,与此同时WB实验显示高糖培养情况下CFs的α-SMA与Collagen I的表达相对于正常糖培养显著升高。转染实验表明:在转染miR-369-5p inhibitors及阴性对照组后,inhibitors组miR-369-5p的m RNA相对表达量较空白组、阴性对照组显著减少。与此同时瞬时转染miR-369-5p inhibitors后,inhibitors组α-SMA、Collagen I表达量较空白组、阴性对照组显著增多。瞬时转染miR-369-5p inhibitors后,inhibitors组α-SMA、Collagen I蛋白表达量较空白组、阴性对照组显著增多。转染miR-369-5p inhibitors后CCK-8实验表明inhibitors组CFs活力显著高于空白组和阴性对照组.结论以上实验结果表明,抑制miR-369-5p的表达,可以提高CFs的活化增殖的表达,与此同时α-SMA与Collagen I的表达会相应提高。这就表明miR-369-5p可能在糖尿病心肌病背景下作为调控CFs活化增殖的靶分子之一,进而抑制心肌纤维化的发生,并且为干预和预防糖尿病心肌病提供新思路。
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