白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.)是瑞香科沉香属常绿乔木,其含树脂的木材沉香是名贵药材和名贵天然香料,具有极高的经济价值。白木香是我国特有的珍贵药用植物,也是我国生产国产沉香的唯一植物资源。长期以来由于白木香自然繁殖率低及人为掠夺式砍伐等原因,野生白木香资源遭到严重的破坏,现已被列为国家二级重点野生保护植物。由于缺乏准确有效的检测手段以及对沉香需求量的不断增加,市场上出现了大量沉香伪品、劣品,严重扰乱了药材市场秩序及临床药用安全。 本文从细胞水平和分子水平研究白木香的遗传多样性,为保证药材资源的可持续发展、保护有限的白木香资源奠定了基础。同时采用DNA分子遗传标记技术鉴别国产沉香药材及其伪品,建立了特异、稳定、快捷的分子鉴别新方法。本文的主要研究结果如下： (1)用常规压片法和改良BSG法制作染色体标本,分别研究了广东茂名、广西南宁和海南屯昌三个居群白木香染色体的核型和C-带带型。结果表明,三个居群白木香的核型公式均为。K(2n)=2x=16=6m+6sm+4st,核型类型均为“2B"型,属于较不对称的类型。各地白木香核型不对称系数(As.K.％)变化较小,平均为68.33％。不同产地白木香染色体的C-带带型有所不同,表现在C-带的数量、位置、强弱和大小等方面。白木香染色体带型带型以末端带,着丝粒带和中间带为主。白木香的C-带带纹有所分化,但各染色体带纹数量较少,分化较为有限,进化地位不是很高,与核型分析结果一致。白木香居群内染色体的变异很小。 (2)采用简单重复序列区间(ISSR)扩增技术,对不同地区9个居群白木香的遗传变异、亲缘关系及分子鉴别进行研究。筛选出7条ISSR引物,获得80条清晰可辨的条带,其中多态性条带47条,多态性程度达到58.8％。白木香居群间的遗传距离为0.0733～0.4213,种内遗传变异程度较低。根据遗传距离和聚类分析结果可知,9个居群的白木香可分为3个类群,云南沉香与各个居群白木香的亲缘关系较远。引物IS-8在白木香居群之间扩增条带的数目和位置各不相同,由此可以进行白木香种内和种间的鉴别。ISSR分子标记可作为白木香遗传多态性、亲缘关系和分子鉴别的有效手段。 (3)利用直接测序的方法测定了不同地区白木香及云南沉香的ITS序列和trnL-trnF序列,并分别比较了居群间ITS序列和trnL-trnF序列的差异,为白木香的分子鉴别、道地药材的栽培和质量评价提供依据。白木香ITS区总长度为680bp,在白木香种内的变异很小,碱基遗传距离为0.000～0.011。白木香trnL-trnF间隔区序列长度在419～421bp,富含A/T。居群间变异位点为13个,除了有碱基替换,还发生了缺失和插入的现象。两个序列的测序结果均说明白木香种内发生了遗传分化,序列间的差异为鉴别不同产区白木香及其近缘种提供了依据。 (4)对白木香、云南沉香及国产沉香伪品樟树的ITS序列进行比对,根据序列间的差异,设计筛选出了沉香属的属特异性引物和白木香的种特异性引物,运用二重PCR技术进行了特异引物PCR。电泳结果显示,白木香可以扩增出条带为236bp的种特异性条带和334bp的属特异性条带；云南沉香只能扩增出334bp的属特异性条带；樟树则没有条带扩增出来。根据电泳图谱,可以将三者区别开。 (5)在ITS序列分析的基础上,利用软件寻找合适的酶切位点,发现限制性内切酶BssS I在白木香、云南沉香ITS序列的不同位点上有酶切位点,而樟树则没有发现该酶的酶切位点。通过琼脂糖电泳可以看出,白木香经过酶切后得到了535bp和214bp的酶切片段；云南沉香为467bp和282bp;樟树ITS片段没有被切开,仍保持在700bp左右。根据电泳条带的分布位置,可以将三者进行鉴别。 (6)分别采用二重PCR和PCR-RFLP技术对国产沉香药材进行鉴别,发现二重PCR技术可以有效的鉴别国产沉香,所有样品都得到了预期结果；而PCR-RFLP技术只成功鉴别了部分药材。由于二重PCR扩增的片段较短,仅有334bp,特别适合于基因组严重降解的中药材的鉴别,而且对反应体系的要求不如RFLP高,所以鉴别的成功率高于PCR-RFLP。因此我们认为二重PCR可作为中药材鉴别的一种有效方法。