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研究背景:胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一,也是我国癌症死亡的重要因素,其发病率和死亡率位居全部肿瘤的前列。目前,尽管手术治疗、化学治疗和放射治疗等传统的治疗手段在一定程度上延长了患者的生存时间,但由于肿瘤细胞的侵袭和转移,使得多数患者的预后效果并不理想,生存率较低;治疗手段的局限性和较低的早期诊断率使得我国胃癌诊疗形势十分严峻。因此,如何有效的降低肿瘤细胞的恶性增殖和转移对治疗胃癌具有重要意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200nt且不编码蛋白质的RNA,可通过调控微小RNA(microRNAs,miRNAs)和相关基因的表达,在调节细胞增殖、迁移和侵袭等生物学过程中发挥着重要作用,参与胃癌在内的多种肿瘤疾病的生理病理过程。同源盒基因A11反义RNA(homeobox-containing A11 antisense RNA,HOXA11-AS)是一种与肿瘤发展关系密切的lncRNA,在多种肿瘤细胞中异常高表达,发挥着致癌作用。miR-148a是一种位于7p15.2染色体上的miR-148/152家族成员,以癌基因或抑癌基因的角色影响着多种肿瘤的发生发展。WNT1是WNT基因家族成员之一,也是经典的WNT/β-catenin信号通路的重要组成部分,其可通过与跨膜受体结合激活胞内散乱蛋白,使胞内β-catenin积累增多,转入细胞核,激活相关基因的表达,进而影响着细胞功能。胃癌的发生发展是一个多基因、多阶段和多机制的复杂过程,其确切机制尚不清楚;尽管HOXA11-AS、miR-148a和WNT1/β-catenin信号通路在胃癌中的作用已有报道,但基因网络的调控机制十分庞大而复杂,三者间是否存在联系,能否通过相关作用促进胃癌进程尚未可知。我们通过收集胃癌组织标本,观察HOXA11-AS的表达情况,并分析其表达水平与临床病理特征的关系。通过Starbase生物信息学软件预测到HOXA11-AS 3’UTR与miR-148a存在靶向结合位点,TargetScanHuman软件预测WNT1 3’UTR中含有与miR-148a互补的核苷酸序列。因此推测,HOXA11-AS可能通过靶向吸附miR-148a进而激活其靶基因WNT1介导的WNT1/β-catenin信号通路促进了胃癌的进程。为了验证上述猜想,我们设计了本实验。实验总共分为三大部分:第一部分lncRNA HOXA11-AS通过调控miR-148a调节胃癌进程目的:探讨HOXA11-AS靶向miR-148a对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用RT-PCR检测了50例胃癌组织和胃癌细胞系中HOXA11-AS的表达水平,并分析HOXA11-AS表达与临床病理特征的关系。构建HOXA11-AS过表达的胃癌SGC-7901细胞株和HOXA11-AS沉默的MGC-803细胞株,采用CCK-8法、克隆形成实验和Transwell小室检测HOXA11-AS对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。采用Starbase生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验和RIP实验分析HOXA11-AS和miR-148a的靶向关系,RT-PCR检测HOXA11-AS对miR-148a表达的影响和miR-148a在胃癌组织、细胞中的表达情况。构建miR-148a上调的SGC-7901细胞和miR-148a下调的MGC-803细胞,采用CCK-8法、克隆形成实验和Transwell小室检测miR-148a对HOXA11-AS过表达或沉默的胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。采用慢病毒介导的HOXA11-AS基因转染胃癌SGC-7901细胞后,腋窝皮下接种构建胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤模型,观察干扰HOXA11-AS表达对胃癌裸鼠移植瘤生长和miR-148a表达的影响。结果:HOXA11-AS在胃癌组织和细胞中高表达。HOXA11-AS表达水平与患者年龄和性别无关(P>0.05),但与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)。HOXA11-AS过表达可促进SGC-7901细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,反之则抑制MGC-803细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实miR-148a是HOXA11-AS的靶基因;实时荧光定量PCR检测证实HOXA11-AS可负向调控miR-148a表达,miR-148a在胃癌组织和细胞中表达降低。上调miR-148a表达可逆转HOXA11-AS过表达对SGC-7901细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的促进作用,下调其表达可逆转HOXA11-AS沉默对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用。同时,成功下调HOXA11-AS表达后,胃癌裸鼠移植瘤生长明显受到抑制,miR-148a表达明显升高。结论:HOXA11-AS在胃癌中高表达,可通过靶向miR-148a促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其有望成为胃癌诊断和治疗的新靶点。第二部分miR-148a通过WNT1/β-catenin信号通路调节胃癌进程目的:探讨miR-148a通过调控WNT1/β-catenin信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用TargetScanHuman软件预测,双荧光素酶报告基因实验和RIP实验分析miR-148a与WNT1的靶向关系;免疫组化实验和RT-PCR检测了50例胃癌组织中WNT1表达;RT-PCR检测胃癌细胞中WNT1 mRNA表达水平;构建miR-148a过表达的SGC-7901细胞株和miR-148a沉默的MGC-803细胞株,Western blot检测miR-148a对WNT1/β-catenin信号通路相关蛋白WNT1和β-catenin表达的影响。进一步构建WNT1过表达的SGC-7901细胞株和WNT1沉默的MGC-803细胞株,CCK-8法、克隆形成实验、Transwell小室实验检测miR-148a靶向WNT1对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。结果:WNT1 3’UTR中含有与miR-148a互补的核苷酸序列,双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实WNT1是miR-148a的潜在靶基因。WNT1在胃癌组织和细胞中高表达;miR-148a过表达的SGC-7901细胞中WNT1和β-catenin蛋白的表达水平明显降低,而在miR-148a沉默的MGC-803细胞中WNT1和β-catenin蛋白明显升高。上调WNT1表达能够明显逆转miR-148a过表达对SGC-701细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用;而下调WNT1表达能够明显逆转miR-148a沉默对MGC-803细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的促进作用。结论:WNT1是miR-148a的潜在靶基因,在胃癌组织和细胞中高表达;miR-148a可通过靶向WNT1调控WNT1/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭过程。第三部分HOXA11-AS与miR-148a调控WNT1/β-catenin信号通路的机制研究目的:探讨HOXA11-AS介导miR-148a对WNT1/β-catenin信号通路的影响。方法:根据前期RT-PCR检测胃癌组织中HOXA11-AS、miR-148a和WNT1的表达水平,采用Pearson相关性分析三者的相关性。构建HOXA11-AS和miR-148a过表达的SGC-7901细胞株以及HOXA11-AS和miR-148a沉默的MGC-803细胞株后,采用Western blot检测HOXA11-AS和miR-148a共表达和沉默对WNT1/β-catenin信号通路相关蛋白WNT1和β-catenin的影响。结果:HOXA11-AS和miR-148a的表达呈显著负相关,WNT1 mRNA和miR-148a的表达呈显著负相关,而HOXA11-AS和WNT1 mRNA的表达呈显著正相关。HOXA11-AS过表达可上调SGC-7901细胞中WNT1和β-catenin蛋白表达,诱导WNT1/β-catenin信号通路活化;而上调miR-148a表达能够明显逆转HOXA11-AS过表达诱导的WNT1/β-catenin信号通路活化。HOXA11-AS沉默可下调MGC-803细胞中WNT1和β-catenin蛋白表达,抑制WNT1/β-catenin信号通路活化,而下调miR-148a表达能够明显逆转HOXA11-AS沉默对WNT1/β-catenin信号通路活化的抑制作用。结论:胃癌组织中HOXA11-AS与miR-148a的表达呈负相关,与WNT1的表达呈正相关,而WNT1和miR-148a的表达呈负相关;HOXA11-AS可通过介导miR-148a表达诱导WNT1/β-catenin信号通路活化。