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家畜选育已有上万年的历史,自19世纪以来,生物学的发展极大地促进了家畜育种进程。相比于以前的传统转基因和基因打靶技术,基因编辑工具(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9)的问世可以让人们随心所欲地对家畜基因组序列进行改造。体细胞克隆技术与基因编辑技术的结合使得人们生产特定基因编辑的动物成为可能。传统转基因技术最大的缺陷就是外源基因的随机整合,会导致内源基因调控功能改变或外源基因不起作用。此外,转基因过程中引入的标记基因和抗性基因会成为潜在的生物安全隐患。“乳糖不耐症”是人群中普遍存在的一种现象,表现为对乳糖不耐受,摄取乳糖后会导致腹胀腹泻等症状。嗜热古菌乳糖分解酶(Lactase Sulfolobus Solfataricus,LacS)是一种来源于嗜热古细菌的能够水解乳糖的耐热酶,其最佳水解温度为75-100℃。本研究拟基于微同源末端连接通过TALEN技术将LacS基因插入到奶牛基因组并在乳腺组织特异表达,以期得到能够正常泌乳并在乳汁中含有乳糖分解酶的无标记基因编辑奶牛,生产低乳糖饮用奶,从源头为乳糖不耐受症的解决提供新方法。全文结果如下:(1)选取约60d胚龄奶牛胎儿,采用组织块贴壁法建立了奶牛胎儿成纤维细胞系,经形态分析、生长曲线测定和测序分析,适合进行LacS基因敲入研究。(2)基于奶牛β-casein第二内含子区域序列设计了2个TALEN靶位点作为潜在LacS基因插入位点,构建TALEN质粒,经活性验证确认后1对有活性。同时构建了包含针对靶位点微同源序列的LacS基因载体。(3)TALEN载体和LacS基因载体共转染奶牛成纤维细胞后,口吸管法接种单细胞至96孔板中,经培养得到单细胞株,提取其基因组DNA后进行两步PCR及测序分析。共得到124个细胞株,经分析1个为无标记转LacS基因阳性细胞株,阳性率0.8%。(4)以阳性细胞株为供体细胞采用体细胞核移植法构建了重构胚,卵裂率为66%(188/288),囊胚率为27%(51/188)。对同期发情的20头受体牛进行胚胎移植,90 d妊娠率为20%(4/20)。