L-半胱氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸中唯一带有巯基的氨基酸,由于侧链上巯基极性强,因而具有一些特殊的反应特性。L-半胱氨酸广泛应用于医药、食品、化妆品行业中,而且从未停止对L-半胱氨酸新用途的开发。微生物酶法转化DL-2-氨基-△2-噻唑林-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸是研究和开发的一个热点。很多氨基酸的生产是利用微生物通过诱导出能够降解某种作为氮源的含氮物质的酶水解出相应氨基酸。如乙内酰脲及其衍生物,嘧啶等都可通过还原途径作为氮源诱导酶的产生。DL-ATC诱导L-半胱氨酸酶的产生与其相似。研究人员对筛选到的菌株L-半胱氨酸的酶克隆表达、酶学性质的研究、产酶的优化等进行了一系列研究,但关于大量高酶活含酶细胞的生产却鲜有报道。本研究通过对转化DL-ATC菌株的筛选,以代谢和调控理论为基础,利用两阶段发酵生产L-半胱氨酸合成酶的高效生产,并对酶反应过程和动力学进行了初步研究,得到如下结论：通过对27份来自不同地区的土样进行筛选,得到假单胞菌F12可以利用DL-ATC合成L-半胱氨酸。该菌可以以DL-ATC为唯一碳氮源进行生长和产酶。通过分别加入其他氮源和碳源的酶活分析表明,DL-ATC作为碳源或氮源都可以诱导L-半胱氨酸酶的产生。由于DL-ATC在消耗过程中释放出易利用的氮源氨,DL-ATC在酶的诱导过程中主要作为碳源受到调控和诱导酶的合成。将假单胞菌F12培养于含有DL-ATC的丰富培养基中,与简单培养基中的结果相比,合成L-半胱氨酸的能力大大下降,可能酶的转录受到严格的调控,而丰富培养基中含有代谢抑制物导致。摇瓶的两阶段实验中考察了葡萄糖对于产酶的影响及酶合成的规律,酶的合成主要受到分解代谢物阻遏(Carbon Catabolic Repression, CCR),并受到多种调节子的全局调控。加入葡萄糖的初始酶活有很大的提高,但随着诱导时间的延长会趋于恒定,葡萄糖本身有利于产酶,但由于DL-ATC利用过程中氨的释放作为氮源会降低菌体对DL-ATC的利用,同时葡萄糖利用过程中会产生有害代谢物对产酶不利,可能存在交叉抑制现象。在DL-ATC诱导后期产酶速率不断增加直到DL-ATC耗尽,通过对DL-ATC诱导过程中氮的物料平衡分析,在诱导后期,消耗等量DL-ATC菌体量增加下降(菌体中所含氮下降),释放的氨下降,因此必然有氮流向其他物质的合成,这可能是受到PtsNtr系统调节作用以平衡C/N比例。外源氨存在时诱导后期也会出现氮的流向改变,但只在一定范围内不影响酶活,表明氮源的其他流向可能抑制产酶。5-L罐的两阶段培养中在诱导后期DL-ATC消耗速率不变,而酶活下降,且此时溶氧开始保持平稳不再下降,很可能产酶跟菌体的耗氧代谢有关。5-L罐中分别采用葡萄糖和乙酸为碳源生长的两阶段培养生产L-半胱氨酸合成酶,最高酶活分别达到302U/mL和283U/mL,对DL-ATC的得率分别为18875U/g和21439U/g,此时最终菌浓分别为9.70g/L和16.3g/L。虽然后者菌浓明显高于前者,但体积酶活和比酶活并没有提高。通过对葡萄糖和乙酸生长菌体的摇瓶诱导的考察,发现乙酸生长的菌体对酶的诱导水平低于葡萄糖生长菌体,这可能是由于乙酸生长的菌体代谢途径与葡萄糖代谢途径不同所致,而在细胞重新利用DL-ATC生长时,必须耗费能量和碳氮源启动这些基因的表达,因此造成酶合成的延滞和水平偏低。对酶反应条件的考察发现硫化氢对L-半胱氨酸的降解有一定抑制作用,通过向反应液中通入硫化氢可以大大减少L-半胱氨酸的降解。TLC法鉴定反应中间产物为S-氨甲酰-L-半胱氨酸,该物质可自发水解,也可在酰胺水解酶作用下酶解,但在酶存在时主要通过酶解的方式生产L-半胱氨酸和氨。该酶比较稳定,但L-ATC水解酶较不稳定,这也是制约反应得率的重要因素。