脂肪组织慢性炎症和代谢失衡是肥胖胰岛素抵抗的关键因素,脂肪前体细胞巨噬样重编程是脂肪组织区域免疫异常的重要环节,而脂肪组织米色脂肪细胞白色变则是脂肪组织代谢失衡的主要因素。核转录因子PPARγ对脂肪组织巨噬细胞的募集与极化以及脂肪组织代谢倾向性均具有调控作用。因此,调控PPARγ表达的上游信号分子是肥胖脂肪细胞重编程的核心因子。研究证实,在肥胖脂肪组织及血清中存在大量的miRNA,可能是由于脂肪细胞肥大坏死或病变脂肪细胞分泌释放所致。实验室前期研究证明肥胖脂肪组织会分泌miR27a,且脂肪来源的miR27a促进了脂肪组织巨噬细胞的募集和极化以及诱导骨骼肌胰岛素抵抗,同时有研究表明miR27a可以促进体细胞重编程,并参与调节脂肪前体细胞向白色脂肪细胞还是棕色脂肪细胞分化。此外,生物信息学分析以及课题组前期工作均证实,PPARγ是miR27a的下游靶点。但是miR27a是否通过抑制PPARγ诱导脂肪细胞重编程的作用及分子机制尚不清楚。鉴于课题组前期工作表明miR27a可抑制PPARγ表达,激活NF-κB途径,且与肥胖胰岛素抵抗以及脂肪组织慢性炎症呈正相关,鉴于PPARγ通过线粒体动力学、线粒体生物合成及线粒体自噬同时参与脂肪细胞代谢性重编程的发生,因此推测,miR27a通过调控下游靶基因PPARγ,一方面可以激活炎症信号通路,促进脂肪前体细胞向巨噬样细胞的重编程,另一方面可能通过干扰线粒体动力学与线粒体生物合成抑制白色脂肪细胞米色变,以及诱导米色脂肪细胞发生线粒体自噬,促进米色脂肪细胞白色变,参与调控脂肪细胞代谢性重编程,引起肥胖诱导胰岛素抵抗的发生。本研究拟在整体及细胞水平,给予miR27a和(或)PPARγ干扰,探讨miR27a通过抑制PPARγ表达,参与调控脂肪细胞重编程,诱导胰岛素抵抗发生的作用机制,阐明miR27a在肥胖过程脂肪组织区域性免疫与代谢失衡的细胞及分子网络调控中的作用,为肥胖诱导胰岛素抵抗新靶点的发现提供理论基础。本论文研究内容包括两个部分。第一部分探讨miR27a通过抑制PPARγ诱导脂肪前体细胞巨噬样重编程的作用机制。1.明确miR27a是脂肪前体细胞巨噬样重编程的关键调控因子建立C57BL/6J小鼠高脂饮食及miR27a干预模型。结果表明,miR27a参与调节模型小鼠血清生化学指标、葡萄糖耐量与胰岛素耐量,促进模型小鼠血清及脂肪组织分泌炎性因子,影响脂肪组织形态;此外,miR27a的过表达增加了脂肪前体细胞表面抗原F4/80和MHC阳性细胞的数量,增强了脂肪前体细胞的吞噬能力和迁移能力,证明miR27a是促进脂肪前体细胞巨噬样重编程的关键因子。2.探讨miR27a通过抑制PPARγ诱导脂肪前体细胞巨噬样重编程的分子作用机制C57BL/6J小鼠给予miR27a干预后检测各组脂肪组织PPARγ基因与蛋白表达情况。结果显示,过表达miR27a组与高脂饮食组小鼠脂肪组织PPARγ基因及蛋白水平较低脂饮食组均显著降低,而与高脂饮食组比较,敲降miR27a组脂肪组织PPARγ基因与蛋白水平显著升高。我们检测脂肪前体细胞3T3-L1过表达miR27a前后PPARγ与NF-κB炎性信号通路蛋白表达情况;进一步联合PPARγ激动剂罗格列酮干预。结果显示,过表达miR27a后,脂肪前体细胞PPARγ蛋白表达水平显著降低,并激活了炎症信号传导途径。此外,我们观察到罗格列酮刺激的PPARγ活化通过NF-κB途径抑制脂肪前体细胞3T3-L1中巨噬细胞样特征的发展,揭示了miR27a通过抑制PPARγ,进而激活NF-κB途径,引起脂肪前体细胞巨噬样重编程的分子机制。第二部分探讨miR27a通过抑制PPARγ调控脂肪细胞代谢性重编程的作用机制。1.miR27a与脂肪细胞代谢性重编程的相关性研究建立高脂饮食喂养诱导的C57BL/6J肥胖小鼠模型,联合低温驯化。结果表明,与低脂饮食组比较,高脂饮食组小鼠血清及脂肪组织miR27a水平均显著升高。给予低温驯化后显著降低了高脂饮食组血清及脂肪组织miR27a水平。与低脂饮食组比较,高脂饮食组小鼠脂肪组织细胞体积增大,细胞器减少,UCP-1及产热特异基因表达水平均显著降低。低脂饮食联合低温驯化组趋势与低脂饮食组各指标无显著性差异。与高脂饮食组比较,高脂饮食联合低温驯化组小鼠体重,葡萄糖耐量异常及血清生化学指标均部分得到改善,脂肪组织细胞体积减小,细胞器增加,细胞间隙致密,UCP-1及部分产热特异基因表达水平升高。采用棕榈酸刺激的肥大白色脂肪细胞模型,联合冷刺激。结果显示,与体内实验结果一致,与对照组相比,肥大白色脂肪细胞miR27a基因表达水平显著上调,给予冷刺激后显著回落。同时,相较于对照组,肥大白色脂肪细胞脂滴体积增大,线粒体ATP活性及产热特异基因表达水平均降低,给予冷刺激后以上指标均有所改善。因此,鉴于miR27a水平与白色脂肪细胞米色化指标呈负相关,推测miR27a可能抑制白色脂肪细胞米色化,与肥胖诱导脂肪细胞代谢性重编程密切相关。2.明确miR27a是脂肪细胞代谢性重编程的关键调控因子建立C57BL/6J小鼠高脂饮食及miR27a干预模型;通过给予肥大的白色脂肪细胞敲降miR27a、米色脂肪细胞过表达miR27a,以及通过制备条件培养液,采用条件培养液与米色脂肪细胞共孵育,检测相关指标变化。结果显示,与低脂饮食组比较,过表达miR27a组趋势与高脂饮食组一致,脂肪组织细胞体积变大,细胞器减少,脂肪组织UCP-1表达及产热特异基因水平均显著降低。与高脂饮食组比较,敲降miR27a组小鼠脂肪组织细胞体积减小,细胞器增加,细胞间隙致密,UCP-1及产热特异基因表达水平升高。敲降miR27a后,肥大白色脂肪细胞脂滴体积减小,线粒体ATP活性及产热特异基因表达水平均显著性升高;而米色脂肪细胞过表达miR27a以及同含有miR27a的条件培养液共孵育后,脂滴体积增加,线粒体ATP活性、UCP-1蛋白及产热特异基因表达水平均降低。这些数据表明,miR27a可以抑制白色脂肪细胞米色化,同时,促进米色脂肪细胞白色化。本研究证明miR27a参与白色与米色脂肪细胞的转分化,是调控脂肪细胞代谢性重编程的关键因子。3.阐明miR27a通过PPARγ影响脂肪细胞代谢性重编程的分子作用机制建立C57BL/6J小鼠高脂饮食及miR27a干预模型,以及肥大的白色脂肪细胞敲降miR27a联合PPARγ抑制剂T0070907干预模型,检测线粒体动力学相关信号通路蛋白与线粒体生物合成相关通路蛋白表达水平变化。结果表明,高脂饮食及miR27a过表达抑制了脂肪组织PPARγ-Bnip3信号通路,抑制Drp-1表达,阻碍了线粒体分裂,但对线粒体融合蛋白Opa-1水平并无明显影响。同时,miR27a过表达降低了PGC-1α、Nrf-1与Nrf-2的蛋白表达水平,抑制了线粒体生物合成。然而,高脂饮食联合慢病毒敲降miR27a则与之相反,提高了脂肪组织PPARγ与Bnip3蛋白表达水平,促进了脂肪细胞的线粒体分裂与生物合成相关蛋白表达。在细胞水平我们检测了线粒体动力学及线粒体生物合成相关通路蛋白,结果与体内高脂饮食联合慢病毒敲降miR27a水平一致,肥大白色脂肪细胞敲降miR27a提高了PPARγ、Bnip3与Drp-1表达,对Opa-1蛋白水平并无明显影响,同时提高了PGC-1α、Nrf-1与Nrf-2的蛋白表达水平。此外,我们观察到PPARγ抑制剂T0070907的干预,则扭转了miR27a敲降的影响,提示miR27a可能通过抑制PPARγ,干扰线粒体分裂-融合平衡以及线粒体生物合成抑制白色脂肪细胞向米色脂肪细胞的转分化。建立C57BL/6J小鼠低脂饮食及miR27a干预模型,米色脂肪细胞过表达miR27a联合PPARγ激动剂罗格列酮干预模型,检测线粒体自噬相关蛋白的表达情况。结果表明,给予动物及米色脂肪细胞过表达miR27a后,PPARγ蛋白表达水平降低,FUNDC1、LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5和ATG12蛋白表达水平显著升高,PPARγ激动剂罗格列酮刺激的PPARγ活化通过FUNDC1途径抑制了米色脂肪细胞向白色脂肪细胞样特征的发展。证明miR27a通过抑制PPARγ,诱导米色脂肪细胞线粒体自噬,促进米色脂肪细胞向白色脂肪细胞转化。因此,本课题阐明了1.脂肪细胞重编程在肥胖诱导胰岛素抵抗中发挥重要作用;2.miR27a是脂肪细胞巨噬样重编程和代谢性重编程的关键因子;3.miR27a通过抑制PPARγ,进而激活NF-κB途径,引起脂肪前体细胞巨噬样重编程的分子机制;4.miR27a通过抑制PPARγ,抑制Bnip3途径与PGC-1α途径,引起白色脂肪细胞线粒体动力学及线粒体生物合成失衡,抑制白色脂肪细胞米色化的分子机制;5.miR27a通过抑制PPARγ,激活FUNDC1途径,引起米色脂肪细胞线粒体自噬,促进米色脂肪细胞白色化的分子机制。本实验为肥胖诱导胰岛素抵抗提供了新机制,为肥胖胰岛素抵抗治疗、药物干预新靶点的发现提供了理论基础。