目的:许多研究发现乳腺癌病人死亡的重要原因是发生了肿瘤的转移以及肿瘤的复发。最近证实上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生是造成肿瘤转移以及复发的重要分子机制。近年许多研究发现,Nanog这一维持胚胎干细胞多潜能性的核心干性转录因子在肿瘤细胞EMT及转移的过程中作为重要的调控因子发挥着作用。在不同类型的肿瘤中,Nanog是由其亲本基因Nanog1和逆基因Nanogp8以不同的比例参与编码的。在我们本次研究中,我们研究发现,乳腺癌细胞中表达的Nanog仅仅来源于其假基因Nanogp8的编码转录,而且定位于细胞核中。尽管如此,Nanogp8是否像Nanog一样发挥着转录因子的功能并且参与到乳腺癌EMT过程中以及其详尽的分子机制还不清楚。在本次研究中我们拟采用基于慢病毒的sh RNA干扰等一系列分子生物学和细胞生物学研究技术、并结合细胞EMT发生模型及免疫缺陷小鼠转移模型分析探讨Nanogp8在乳腺癌EMT过程中的调控作用及其详尽的分子机制。方法:1)采用核酸序列分析的方法探究乳腺癌细胞中表达的Nanog的来源;通过免疫荧光实验来观察乳腺癌细胞中Nanog的定位。2)通过Western blotting来分析乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231中Nanogp8的表达水平;基于慢病毒技术提高乳腺癌细胞MDA-MB-231中Nanogp8表达水平,并观察细胞形态学变化;通过Western blotting和RT-PCR技术来检测上调Nanogp8后,乳腺癌细胞中EMT相关分子指标的表达水平变化;采用免疫荧光染色进一步观察乳腺癌细胞中Nanogp8表达上调对EMT相关分子指标的定位及表达的影响;采用transwell小室体外迁移、侵袭实验来检测乳腺癌MDA-MB-231细胞高表达Nanogp8后其迁移和侵袭能力的变化。3)采用基于慢病毒的sh RNA在乳腺癌T47D细胞系中降表达Nanogp8,观察细胞形态学变化;通过Western blotting和RT-PCR技术来检测下调Nanogp8后,乳腺癌细胞中EMT相关分子指标的表达水平变化;采用免疫荧光染色进一步观察乳腺癌细胞中Nanogp8表达下调对EMT相关分子指标的定位及表达的影响;对乳腺癌Nanogp8稳定降表达的T47D细胞采用transwell小室体外迁移、侵袭实验来检测下调Nanogp8后细胞的迁移以及侵袭能力的变化情况。4)观察Nanogp8稳定降表达的细胞及对照组细胞在SCID小鼠中转移能力的变化。通过动物体内实验探究Nanogp8下调对乳腺癌细胞转移能力的影响。5)通过生物信息学分析及双荧光素酶报告基因检测系统和Chip技术来探究Nanogp8对Snail的启动子活性是否有直接调控作用。6)运用Western blotting和transwell小室体外侵袭实验来检测在下调Nanogp8的基础上,再下调Snail后乳腺癌细胞T47D中EMT相关分子指标的变化及细胞侵袭能力的变化。7)采用生物信息学分析及双荧光素酶报告基因检测系统和Chip技术来验证Nanogp8对E-cadherin的启动子活性是否有直接调控作用.8)运用生物信息学分析及双荧光素酶报告基因检测系统和Chip技术来探究STAT3对Nanogp8的启动子活性是否有直接调控作用.9)采用Western blotting和RT-PCR技术来检测STAT3降表达后乳腺癌细胞中Nanogp8蛋白及m RNA表达水平的变化;通过免疫荧光实验来观察STAT3降表达后乳腺癌细胞中Nanogp8定位变化。10)通过基于慢病毒的sh RNA技术筛选STAT3降表达的稳定乳腺癌细胞系,并观察细胞形态变化;通过Western blotting和RT-PCR技术来检测降表达STAT3后,乳腺癌细胞中EMT相关分子指标的表达变化;采用免疫荧光染色进一步观察乳腺癌细胞中STAT3表达下调对EMT相关分子指标的定位及表达的影响;采用transwell小室体外迁移、侵袭实验及划痕实验来检测乳腺癌细胞降表达STAT3后其迁移和侵袭能力的变化;在免疫缺陷小鼠转移模型中研究下调STAT3的表达对乳腺癌细胞转移能力的影响。11)运用双荧光素酶报告基因检测系统探究STAT3对Nanogp8转录活性的调控作用;采用Western blotting和transwell小室体外侵袭实验检测在下调Nanogp8的基础上,再下调STAT3后乳腺癌细胞T47D中EMT相关分子指标的变化及细胞侵袭能力的变化。12)通过免疫缺陷小鼠转移模型来检测乳腺癌T47D中同时下调Nanogp8和STAT3后,细胞在动物体内转移能力的变化。结果:1)通过核酸序列测序比对,发现乳腺癌细胞中表达的Nanog仅来源于其逆基因Nanogp8的编码,而且和Nanog一样属于核定位。2)Nanogp8的蛋白表达水平在乳腺癌细胞系MCF-7中显著高于T47D和MDA-MB-231,后两者中前者略高于后者;当在乳腺癌MDA-MB-231细胞中上调Nanogp8后,细胞形态由原来的长梭形变为连接较为紧密的鹅卵石样,即发生了显著的间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET),EMT相关分子指标也发生了一致性的变化而且细胞的体外迁移和侵袭能力显著降低。3)在T47D中降表达Nanogp8后细胞发生了明显的EMT现象,且EMT相关分子指标也发生了一致性的变化即E-cadherin表达显著下降,间质指标Vimentin和Snail明显升高而且细胞的体外迁移和侵袭能力也显著增强。4)下调Nanogp8显著增强了乳腺癌T47D细胞的体内转移能力。5)Nanogp8在Snail的启动子区存在结合位点且直接抑制Snail启动子活性。6)下调Snail的表达没有显著地逆转由Nanogp8降表达引发的乳腺癌细胞EMT,细胞的体外侵袭能力也没有十分明显的减弱。7)Nanogp8在E-cadherin的启动子区存在结合位点且直接加强E-cadherin的启动子活性。8)STAT3在Nanogp8的启动子区存在结合位点且直接抑制Nanogp8的启动子活性。9)下调STAT3的表达后,乳腺癌细胞中Nanogp8的蛋白和m RAN表达水平明显提高,而Nanog P8仍为核定位。10)在乳腺癌MDA-MB-231和T47D细胞中下调STAT3后,细胞均发生了MET现象,其EMT相关指标均发生了一致性的变化,细胞迁移及侵袭能力显著减弱,而且STAT3降表达明显抑制了细胞体内转移能力。11)下调STAT3的表达显著增强了Nanogp8的转录活性。STAT3的下调不能逆转由Nanogp8下调引发的乳腺癌EMT。12)下调STAT3不影响Nanogp8稳定降表达细胞的体内转移能力。结论:本课题组研究发现外源性高表达Nanogp8使乳腺癌细胞发生MET现象,而降表达Nanogp8明显的促进了乳腺癌EMT过程,同时也增强了乳腺癌细胞体外的迁移、侵袭能力和动物体内的转移能力。而且,我们进一步发现Nanogp8负调控乳腺癌EMT过程是通过直接抑制转录因子Snail的启动子活性,这个转录因子是E-cadherin表达的重要抑制因子;或者通过直接抑制E-cadherin的启动子活性,而E-cadherin在肿瘤发生EMT过程中起到的“守门员”的作用。另外,我们证实STAT3通过直接抑制Nanogp8的启动子活性和转录活性来充当上游调控因子,参与到Nanogp8负调控乳腺癌EMT的过程中。我们的研究揭示了一条新的存在于乳腺癌EMT及转移过程中的信号通路即STAT3/Nanogp8/E-cadherin信号轴。