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疾病给猪生产带来很大的养殖风险并增加防疫治疗成本,而且预防和治疗的大量用药,导致猪肉食品安全受到潜在威胁。从遗传上降低猪的疾病易感性和提高抗病能力,可以很好解决此问题。BPI基因在其他物种已经研究比较多,有希望成为抗病育种的候选基因。荣昌猪作为地方猪品种,具有抗病抗逆性能好的特点。本研究从体外培养诱导分化荣昌猪骨髓单核细胞(Bone Marrow Mononuclear Cells, BMMNCs)来研究荣昌猪中性粒细胞表达杀菌/通透性增强蛋白基因(Bactericidal/Permeability-Increasing Protein, BPI)的规律,为猪抗病育种提供参考。1猪骨髓单核细胞培养优化改进并建立了市售排骨分离猪BMMNCs的新方法,将市售排骨分离获得的猪BMMNCs细胞与无菌手术条件取得的肋骨分离的猪BMMNCs细胞,经过台盼蓝染色测定活细胞率,差异不显著。使用市售排骨进行猪BMMNCs培养,为造血干/祖细胞、间充质干细胞、骨髓多能干细胞移植等研究提供了便利。研究筛选适宜猪BMMNCs的培养条件为：液体培养,使用RPMI-1640培养液,添加15%FBS,培养环境为5%C02,37℃,饱和湿度。虽然采用离体肋骨分离猪BMMNCs,污染机会并没有显著增加,100U/mL双抗即能达到效果。2猪骨髓单核细胞增殖采用细胞计数、MTS/PMS法结合的方法探讨猪骨髓单核细胞的增殖,研究了胰岛素、地塞米松、SCF、G-CSF、GM-CSF等因子对骨髓单核细胞增殖的影响,筛选出促进增殖的最佳浓度SCF为30ng/ml, G-CSF为40ng/ml, GM-CSF为80ng/ml, IL-3为100ng/ml, IL-6为150ng/ml。胰岛素与地塞米松对猪BMMNCs增殖促进作用不显著。3猪骨髓单核细胞分化采用瑞氏染色、苏丹黑B染色、墨汁吞噬试验、热盐水溶核试验等方法研究不同培养条件下猪中性粒细胞的分化。瑞氏染色、苏丹黑B染色能较好反映分化状态,而墨汁吞噬试验、热盐水融核试验对荣昌猪中性粒细胞的分化展示作用不好结果表明LPS、地塞米松具有显著促进中性粒细胞分化作用,胰岛素、IL-3、IL-4促进中性粒细胞分化作用不显著。体外培养的荣昌猪BMMNCs可以进行中性粒细胞分化,但分化到杆状核和分叶核中性粒细胞阶段的很少见。改进染色与杂交用载玻片。常规细胞涂片或细胞爬片,不能在同一张载玻片上同时对多个组进行染色或杂交操作,不同载玻片进行操作必然加大操作误差。本研究将载玻片用疏水的蜡划分成12格,在不同格里涂不同组细胞悬液,可以同时对12组细胞染色或杂交操作,保证条件完全一致,效果优于常规方法。该载玻片专利申请号201120301873.8。4荣昌猪骨髓单核细胞中BPI表达设计2个mRNA原位杂交探针,5’-CGTGGACACCTTGGGTATGA G-3和5’-TGCTGCTGTTCATCTCAATC-3’,在猪早幼中性粒细胞可以检测到杂交信号,说明在早幼中性粒细胞阶段,BPI就开始表达。经过LPS不同时间刺激后,培养BMMNCs中不同阶段的中性粒细胞BPI mRNA原位杂交阳性率上升,说明LPS可以促进BMMNCs中BPI mRNA合成。5不同SNP基因型的荣昌猪骨髓单核细胞中BPI表达与攻毒试验利用PCR-SSCP技术对荣昌猪外显子3进行基因型判定,选择不同外显子猪取BMMNCs进行培养并进行BPI mRNA原位杂交,结果表明不同外显子对骨髓单核细胞中BPI表达影响不显著,但在LPS刺激下,GG基因型的BMMNCs细胞中不同分化阶段的粒细胞中阳性率上升程度高于AA基因型,并且在攻毒试验中,GG和AA基因型均未表现出对致病性大肠杆菌的具有抵抗作用,但GG基因型个体症状较轻,恢复时间短于AA基因型个体。