论文部分内容阅读
目的:柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)感染所致的病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)严重危害人类健康,也是新生儿猝死的重要原因,目前尚无有效的预防方法。VP1是CVB3的主要中和抗原,能诱导机体产生体液和细胞免疫。以质粒为载体构建的CVB3 VP1基因疫苗免疫小鼠后,虽可诱导产生低效价的中和抗体,但不能有效阻止致死量病毒感染。因此,提高免疫原性、增强免疫效果是CVB3 VP1疫苗亟需解决的问题。目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中,复制缺陷型腺病毒载体系统(Replication-Defective Adenovirus Vector System)以其广泛的宿主范围、极高的转染效率以及外源基因高表达等特点,在疫苗载体选择中表现出优势,成为极具应用前景的基因转移载体。尽管腺病毒载体有较高的转染人体细胞的能力,但表达的蛋白如不能很快地穿梭和扩散到更多的免疫活性细胞,仍不能有效提高抗原提呈效率。因此基因预防的又一关键是使受染细胞表达的抗原蛋白能有效地扩散到免疫活性细胞。VP22是Ⅰ型单纯疱疹病毒UL49基因编码的长301个氨基酸的碱性蛋白质,具有蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD),能够把与之融合的蛋白或与之结合的DNA等大分子跨膜送递到邻近细胞。利用这一特性,将与VP22融合的抗原送递到周围的免疫活性细胞,提高其抗原的提呈效率,可望显著增强疫苗的免疫原性。本研究以CVB3为对象,利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1和rAd/VP1,并观察它们在293细胞中的表达,为构建用于人类的CVB3疫苗奠定基础。方法: 1目的基因的扩增与鉴定以编码VP22蛋白的质粒pAP85H为模板,扩增VP22-Linker基因。以编码VP1蛋白的质粒pcDNA3/VP1为模板,扩增VP1和Linker-VP1基因。将上述3种扩增产物分别与pGEM-T载体连接,转化DH5α大肠杆菌,构建质粒pGEM-T/ VP22-L、pGEM-T/ VP1和pGEM-T/ L-VP1。提取质粒进行酶切鉴定和测序,筛选重组子。2重组穿梭质粒的构建将上述3种质粒以合适的限制性内切酶进行双酶切,回收带粘末端的3种目的片段,将VP1、VP22-Linker和Linker-VP1分别与经相应限制性内切酶双酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,经转化、筛选和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒AdTrack-CMV/VP1和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。3重组腺病毒质粒的构建将pAdTrack-CMV、AdTrack-CMV/VP1和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1 3种质粒分别用内切酶PmeⅠ线性化。利用AdEasy系统,经两步法分别在大肠杆菌Bj5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd、pAd/VP1和pAd/VP22-L-VP1。经PacⅠ酶切,PCR鉴定后,将阳性质粒转化入感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取3种重组质粒,并用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)沉淀法进行纯化。4重组腺病毒的包装与扩增以上重组腺病毒质粒分别用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293(human embryo kidney 293 derived cell line)细胞,并观察报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293细胞,逐日观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),及有无彗星样斑块(FOCI)形成。并经三至四轮传代扩增,提高病毒滴度。5病毒感染后48小时,提取细胞总蛋白,通过Western Blot检测病毒蛋白的表达。6重组腺病毒滴度测定待293细胞在96孔板中生长至70-80%汇合时,以系列稀释的上述各代病毒液感染细胞,感染后48小时GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量(pfu/ml)结果:1成功构建pGEM-T/VP22-L、pGEM-T/VP1和pGEM-T/L-VP1,采用DNA测序和双酶切,证实这3段基因片段均与报道的基因序列一致。2成功构建穿梭质粒AdTrack-CMV/VP1和AdTrack-CMV/VP22-L-VP1,限制酶切分析证明均与预期相符。3成功构建重组腺病毒质粒pAd、pAd/VP1和pAd/VP22-L-VP1,用PacⅠ酶切得到约30kb的片段和一个3.0kb或4.5kb的小片段,PCR鉴定目的基因长度均与预期值相符。4转染48小时后,荧光显微镜下可观察到293细胞有报告基因GFP的表达,表明重组腺病毒rAd、rAd/VP1和rAd/VP22-L-VP1包装成功。初代病毒液再次感染293细胞,在荧光显微镜下可逐日观察到细胞病变和荧光聚集,各代病毒液感染细胞后均有特征性彗星样荧光斑块形成。5重组腺病毒重新感染293细胞48小时后,提取细胞蛋白,经Western Blot检测,VP1、VP22-L-VP1蛋白均有表达。6感染48小时后在荧光显微镜下观察,各组病毒滴度为:rAd初代至第四代病毒滴度分别为1.2×10~5 pfu/ml、4.07×10~6 pfu/ml、1.47×10~7 pfu/ml和9.6×10~7 pfu/ml。rAd/VP1初代至第四代病毒滴度分别为2.67×10~5 pfu/ml、1.82×10~6 pfu/ml、3.67×10~6 pfu/ml和1.6×10~7 pfu/ml。rAd/VP22-L-VP1初代至第四代病毒滴度分别为2.53×10~5 pfu/ml、1.53×10~6 pfu/ml、1.40×10~7 pfu/ml和6.77×10~7 pfu/ml。结论:1成功构建并包装重组腺病毒rAd、rAd/VP1和rAd/VP22-L-VP1,体外感染293细胞可见VP1及VP22和VP1融合蛋白的表达。2经第三、第四轮扩增,每升高一代可使病毒滴度增加约10倍。3本研究利用AdEasy腺病毒载体系统成功包装了重组腺病毒载体疫苗rAd/VP22-L-VP1和rAd/VP1,为发展新型的CVB3载体疫苗奠定基础。