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背景: 中性粒细胞(Neutrophil)-淋巴细胞(Lymphocyte)比(Neutrophil-Lymphocyte Ratio,NLR)被认为是多种疾病的炎症标志物(如1型糖尿病、急性胰腺炎、肾病和视网膜病变等)[1,2,3].研究表明,中性粒细胞是对炎症最快作出反应的细胞,通过与巨噬细胞和抗原呈递细胞相互作用而加重炎症,引起胰岛β细胞损伤诱导1 型糖尿病.糖尿病患者,淋巴细胞凋亡率显著高于正常人,提示 NLR 升高也可能归因于高血糖引起的淋巴细胞数量的减少.目前关于隐匿性糖尿病[按:即空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)正常但是口服葡萄糖试验(Oral Glucose tolerance test,OGTT)异常]患者的NLR是否也升高,尚不清楚.鉴于临床研究条件难控的特点及其伴随的不确定性和复杂性,本课题拟通过动物实验探究 NLR在隐匿型糖尿病模型中的变化,以期验证该指标是否有助于隐匿性糖尿病的早期诊断.NLR的升高可能主要有下列两个原因: 1)糖尿病所导致的以中性粒细胞升高为主要表现的炎症反应; 2)与胰岛功能下降相伴随的间歇性高血糖所引起的、以淋巴细胞减少为主要特征的固有免疫系统稳态的失调.为进一步探明NLR升高的内在机制,我们还给正常大鼠连续7天经口灌胃葡萄糖溶液(6 g/kg/6 h),建造模拟出血糖间歇性波动模型.在OGTT期间,取葡萄糖灌胃前和灌胃后1小时的血,做白细胞分类和计数,从而研究NLR改变的原因. 方法: 1.构建隐匿型糖尿病(Hidden Diabetes,HD)大鼠模型.将90只成年雌性SD大鼠采用随机数表法,先按实验时间分为7天组和27天组(n=45).随后用同样的方法将每组又分为对照组(n=8)和四氧嘧啶诱导隐匿性糖尿病组(n=37).诱导隐匿性糖尿病组大鼠连续两天腹腔注射100 mg/kg四氧嘧啶.对照组大鼠腹腔注射 4℃生理盐水.纳入隐匿型糖尿病模型的标准是 FBG≤110 mg/dL,但是OGTT异常.每天固定时间(下午4点)称重并记录大鼠体重.第一次注射处理的时间定义为P0,随后时间以此类推.7天组大鼠在P7测定FBG、白细胞分类及计数.做完OGTT后,腹腔注射水合氯醛麻醉、取材.取材的脏器有:心脏、肾脏和胰腺.27天组大鼠在P5、P7、P16和P27共计5个时间点测定FBG,在P7和P27取血做白细胞计数及分类.在P24-P25将实验大鼠放入代谢笼,收集24小时尿液并测定饮水量及食物量.尿样离心后取上清于-20℃冰箱中保存,用于检测尿蛋白和尿白蛋白总量.做完OGTT后,腹腔注射水合氯醛麻醉、取材.取材的脏器有:心脏、肾脏和胰腺. 2.构建间歇性高血糖波动模型.选用 21 只成年雌性 SD 大鼠将其随机分为三组(每组n=7):对照组、葡萄糖灌胃组和葡萄糖灌胃(6g/kg)+还原性谷胱甘肽注射(Glutathione Reduced,GSH,50 mg/kg)组.每天灌胃4次,每次间隔6小时,灌胃体积按照1 ml/50g体重计算.对照组用去离子水灌胃,其余两组用去离子水配制的 30%葡萄糖溶液灌胃.在 P7 剪尾取血做白细胞分类和计数,并做OGTT. 3.组织学和免疫组织化学检测:将取材的肾脏和胰腺组织按照本实验室标准流程,用2%多聚甲醛固定组织、梯度酒精脱水、石蜡包埋和组织切片.肾脏组织切片采用苦味酸-天狼星红+苏木素染色(PSR&H)用于观察肾小球的变化;胰腺组织切片采用PSR&H染色和免疫荧光组织化学染色(胰岛素+胰高血糖素+DAPI)用于观察胰腺组织及其β-细胞的变化.用Leica 6000B显微镜将染色完成的组织切片拍照.使用软件Image J测量肾小球面积,用公式计算得出肾小球容积;使用软件Image J测量胰岛面积、计数胰岛β细胞数目,得出β-细胞密度. 4.尿蛋白测定:用BCA试剂盒检测尿样中尿蛋白总量,用Rat Albumin ELISA Kit检测尿样中尿白蛋白总量. 5.数据分析:用GraphPad Prism 6.0将数据绘成统计学图表并进行统计学分析. 结果: 1.四氧嘧啶所导致的HD大鼠特征如下: 1)四氧嘧啶可引起19%的大鼠罹患HD:FBG正常而OGTT异常(p<0.01); 2)HD 大鼠白细胞总数不变,但是中性粒细胞百分比升高,淋巴细胞百分比下降,从而导致NLR值升高(p<<0.05,p<0.001); 3)HD组大鼠的24小时尿量、尿蛋白及尿白蛋白均显著性增加(p<0.05,p<0.001); 4)HD组大鼠的胰腺和肾脏都有较重的病理损伤.胰腺组织学结果显示,残存的胰岛成萎缩状,高倍镜下见胰岛细胞核固缩,细胞浆明显减少,成退行性改变.免疫荧光组织化学结果显示胰岛面积及其 β-细胞数目显著下降(仅为对照组的1/4, p<0.001).肾脏组织学结果,与对照组作比,HD组大鼠的肾脏指数、肾小球面积和容积均升高(p<0.05,p<0.001). 2.在间歇性高血糖波动模型鼠,虽然连续 7 天葡萄糖灌胃没有引起 OGTT 的改变,但白细胞分类却显示出HD白细胞血象的特征:在急性血糖波动时(高糖灌胃1小时前后),中性粒细胞百分比升高、淋巴细胞百分比下降,从而导致NLR升高.造成这种血象特征的原因,主要是由于淋巴细胞数目降低所导致的.虽然中性粒细胞数目不变,但在淋巴细胞数目降低时,其中性粒细胞的分类百分比相对升高(p<0.01). 3.血糖波动所引起的血象改变,可能与葡萄糖所引起的活性氧簇(ROS)的产生及其通路有关,抗氧化剂GSH可完全阻断葡萄糖波动所诱导的淋巴细胞数目及其NLR的变更(p>0.05). 结论: NLR值可作为诊断HD的重要参考指标.当NLR升高且伴有蛋白尿时,就需做OGTT加以确诊.HD的特征是胰岛功能下降难以维持血糖的稳定.血糖波动可造成ROS的改变和淋巴细胞数目减少,从而导致淋巴细胞百分比下降、中性粒细胞百分比和NLR值升高.此外,本研究提示抗氧化剂可延缓HD所引起的固有免疫病理进程.NLR 升高有助于临床早期诊断隐匿性糖尿病,但是准确的阈值目前还尚未明确.