急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种由多种病因导致的急性炎症反应,起病急骤,临床表现多样,轻度患者治疗后短期内即可恢复,预后良好,而重度AP病情进展迅速,可诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),病死率高达30%~50%。目前关于AP的发病机制还未完全阐明,近年来随着研究的深入,人们发现细胞凋亡在AP的发生发展中具有不可忽视的作用。AP中胰腺腺泡细胞损伤主要表现为凋亡和坏死。细胞坏死时各种消化酶和炎症介质随着细胞膜的破坏而释放,从而导致剧烈的炎症反应;而凋亡是程序性细胞死亡,由于细胞膜保持完整,从而减少炎症介质的释放,避免炎症反应进一步加重。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)家族是调控细胞凋亡的关键分子,其中Caspase-3是凋亡执行因子之一。目前已证实,上调Caspase-3表达可通过促进腺泡细胞凋亡而起到保护性作用。Hedgehog(Hh)信号通路在多种动物的胚胎发育、组织再生、干细胞增殖等过程中具有重要作用。研究表明,Hh信号通路不仅与胚胎发育有关,而且与炎症反应及多种肿瘤的发生发展密切相关。已有研究者发现在AP病程中,Hh信号通路具有减轻炎症反应、保护胰腺组织的作用,但是其具体机制尚未明确,特别是Hh信号通路是否可以通过调控胰腺腺泡细胞凋亡影响AP的病程进展,目前未见报道。目的:本实验采用L-精氨酸腹腔注射建立AP大鼠模型,并予Hh信号通路特异性激动剂Purmorphamine进行干预,探究Hh信号通路在AP中对胰腺腺泡细胞凋亡的影响。方法:清洁级成年健康雄性SD大鼠54只,体重220±20 g,随机分为正常对照组(N组)、急性胰腺炎组(AP组)、Purmorphamine干预组(Pur组),每组各18只。各组依据造模时间分为6h、12h、24h三个亚组,每个亚组6只大鼠。本实验采用腹腔注射20%L-精氨酸的方法建立AP模型,剂量为2.5 g/kg×2次,间隔1h。其中Pur组于造模前1h给予Purmorphamine溶液0.69 mg/kg腹腔注射1次。在最后一次腹腔注射后6h、12h、24h,分别处死各组大鼠,观察胰腺及胰周组织情况,留取胰腺组织标本,通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察胰腺组织病理学改变,采用蛋白印迹(western blot)法检测胰腺组织Caspase-3表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)法检测Hh信号通路下游目的基因Ptch1表达水平,末端脱氧核苷酸转移酶d UTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)法检测胰腺腺泡细胞凋亡水平。结果:1胰腺肉眼观察:N组胰腺颜色均匀,周围组织未见明显异常,腹腔内仅有极少量清亮液体;AP组可见胰腺充血水肿、胃肠道积气及血性腹水;Pur组大鼠在各时间点与AP组相比,胰腺充血水肿减轻,胃肠道积气及腹水量较前明显减少。镜下观察:N组胰腺组织在各时间点均未发现明显异常;AP组胰腺组织可见小叶和腺泡间水肿、炎症细胞浸润及腺泡细胞坏死,并且随着时间的推移逐渐加重;Pur组标本在各时间点与A组相比水肿明显减轻,炎症细胞浸润及坏死明显减少。2胰腺腺泡细胞凋亡水平:N组胰腺组织仅有少量阳性细胞零星分布;AP组各时间点阳性细胞较N组明显增加、凋亡指数升高(P<0.05),并且随着造模时间延长而逐渐降低;与AP组相比,Pur组胰腺组织凋亡指数进一步升高(P<0.05),变化趋势与AP组相同。3胰腺组织Caspase-3表达:N组可见Caspase-3少量表达;与之相比,AP组Caspase-3表达增加(P<0.05),但随时间推移逐渐下降;经Purmorphamine预处理后,Pur组Caspase-3表达水平较AP组明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4胰腺组织Ptch1 m RNA表达:N组Ptch1未见明显表达;而AP组与N组相比,各时间点Ptch1表达水平均明显升高(P<0.05),且随时间呈上升趋势;Pur组由于Purmorphamine的作用,Ptch1表达水平较AP组进一步升高(P<0.05)。5相关性分析:胰腺组织凋亡指数与Caspase-3表达水平之间呈正相关(rs=0.911,P<0.01)。胰腺组织Ptch1表达水平与凋亡指数、Caspase-3之间分别存在正相关(rs=0.713,P<0.01;rs=0.648,P<0.01)。结论:1正常对照组大鼠胰腺组织仅有少量凋亡细胞分布,而在AP组早期,凋亡细胞明显增加、凋亡指数升高,之后随着造模时间延长而逐渐下降,同时胰腺病理损伤逐渐加重,说明腺泡细胞凋亡可能在一定程度上抑制AP病情进展。2 Caspase-3作为凋亡执行因子之一,在AP组各时间点的表达均明显增加,并且随时间推移逐渐下降,其表达水平与细胞凋亡指数呈正相关。3作为Hh信号通路的重要组成部分和主要目的基因之一,Ptch1在AP组大鼠胰腺组织中的表达较正常对照组明显增加;应用Hh信号通路特异性激动剂Purmorphamine后,Ptch1的表达较AP组明显增加,表明Hh信号通路在AP大鼠胰腺组织中被进一步激活,参与AP的发生发展。4 Pur组胰腺病理损伤较AP组明显减轻,同时腺泡细胞凋亡指数和Caspase-3表达水平均明显升高;Ptch1与凋亡指数、Caspase-3之间分别存在正相关,提示在AP大鼠胰腺组织中Hh信号通路激活后可能通过上调Caspase-3,而促进胰腺腺泡细胞凋亡,最终减轻胰腺损伤。