【摘 要】
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我国秸秆储量丰富,但是对秸秆的综合利用效率却不高,相当一部分被当做燃料焚烧,这样既浪费了庞大的生物质资源,也造成了环境污染。利用生物法降解秸秆,不仅环保无污染,而且还能生产很多有经济效益的附属产品。玉米秸秆的主要成分是木质纤维素,木质纤维素中木质素与半纤维素相互紧密缠绕,包裹纤维素并且以共价键的方式结合形成立体网状的复杂结构,导致微生物或酶不能直接接触到纤维素与半纤维素,降解效果大打折扣。而利用微
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我国秸秆储量丰富,但是对秸秆的综合利用效率却不高,相当一部分被当做燃料焚烧,这样既浪费了庞大的生物质资源,也造成了环境污染。利用生物法降解秸秆,不仅环保无污染,而且还能生产很多有经济效益的附属产品。玉米秸秆的主要成分是木质纤维素,木质纤维素中木质素与半纤维素相互紧密缠绕,包裹纤维素并且以共价键的方式结合形成立体网状的复杂结构,导致微生物或酶不能直接接触到纤维素与半纤维素,降解效果大打折扣。而利用微生物或酶首先对秸秆进行预处理,降解秸秆中的木质素,释放纤维素与半纤维素,纤维素和半纤维素经过后续的生物降解会最终转化为葡萄糖和木糖,将大大提高玉米秸秆的利用效果。为了降解秸秆中的木质素,本研究首先构建了漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶的表达载体(p YES2-PαLC-r DNA、p YES2-PαLi C-r DNA、p YES2-PαMC-r DNA),利用r DNA整合法将构建的表达载体分别转入酿酒酵母,实现了漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶在酿酒酵母中的高效表达且通过微滴式数字PCR技术测定了转化子拷贝数,研究了拷贝数与酶活力之间的关系。并通过漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶对碱木质素的降解,探究了木质素降解酶系对木质素的作用效果和作用机制。最后对得到的木质素降解酶系酿酒酵母工程菌通过响应面优化了其降解玉米秸秆木质素的条件,研究结果如下:1.构建了漆酶的表达质粒(pYES2-PαLC-r DNA),并转化酿酒酵母,经微滴式数字PCR检测获得了1、3、4、5、6、7、8、9、11和12共10种不同拷贝数的转化子。对其产酶能力进行考察发现当Lac拷贝数小于7时,酶活力随拷贝数增加而提高。当拷贝数为8时,酶活力最高为425 U/L,是1拷贝的4.04倍。当拷贝数大于8时,酶活力随拷贝数的增加而下降;构建了木素过氧化物酶的表达质粒(p YES2-PαLi C-r DNA),并转化酿酒酵母,经微滴式数字PCR检测获得了1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13共12种不同拷贝数的转化子。对其产酶能力进行考察发现当Li P拷贝数小于7时,酶活力随拷贝数增加而提高。当拷贝数为7时,酶活力最高为367 U/L,是1拷贝的3.46倍。当拷贝数大于7时,酶活力随拷贝数的增加而下降。当拷贝数大于10时,酶活力基本趋于稳定;构建了锰过氧化物酶的表达质粒(p YES2-PαMC-r DNA),并转化酿酒酵母,经微滴式数字PCR检测获得了3、4、5、7、8、9、10、11、13和14共10种不同拷贝数的转化子。对其产酶能力进行考察发现当Mn P拷贝数小于9时,酶活力随拷贝数增加而提高。当拷贝数为9时,酶活力最高为204 U/L。当拷贝数大于9时,酶活力随拷贝数的增加而下降。2.漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶三种酶单独存在和不同组合下处理碱木质素,单酶作用时三种酶降解率分别是22.15%、15.44%和12.21%,其中漆酶的作用效果最好,双酶作用时,含漆酶的组合较不含漆酶的组合碱木质素降解率有明显提升,证明漆酶在三种酶的作用中占主要地位,尤其是三种酶共同作用时对碱木质素的降解效果最佳,其降解率为28.98%。降解后的碱木质素表面出现孔洞,结构被破坏,比表面积增加。木质素降解酶系主要破坏了木质素的表观结构和关键化学键,降解产物大多为芳香族小分子化合物。木质素降解酶系可导致碱木质素中大分子苯环结构和基团的开环反应以及化学键的断裂。3.对木质素降解酶系酿酒酵母工程菌降解玉米秸秆木质素的发酵条件进行响应面优化,结果表明该菌发酵的最佳产酶条件为:培养基初始p H值为6.86、发酵温度为29.4℃和搅拌速度为147rpm时,玉米秸秆木质素的降解率为53.7%,较优化前提升了18%。经过电镜、比表面积、傅里叶红外光谱检测,降解后的玉米秸秆光滑表面被侵蚀,出现孔洞,比表面积较降解前增加约3倍,共轭羰基等代表木质素的化学键大大减少,充分证明了玉米秸秆中木质素被降解,木质素降解酶系酿酒酵母工程菌对玉米秸秆中的木质素具有优秀的降解能力。本研究首次将漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶在酿酒酵母中表达,获得的工程菌对玉米秸秆中木质素有较高的降解能力,能有效提高处理后的玉米秸秆中纤维素与半纤维素含量,为纤维素酶和半纤维素酶高效降解处理后的玉米秸秆奠定基础,具有一定的应用价值。
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