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本文以抗盐性很强又有重要利用价值的盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)为材料,利用转录组测序、荧光定量PCR技术结合生理指标的测定,对高盐低氮条件下盐地碱蓬NO3-累积和还原的机制进行初步探究,期望能为盐生植物氮素营养研究提供理论依据。 本研究主要内容包括:⑴从转录组中筛选的六个可能与硝态氮累积和还原相关的CLC和NR基因进行荧光定量PCR。结果表明,在0.5 mM NO3-水平上,200mM NaCl处理条件下盐地碱蓬叶片中CLC-b和CLC-c2的表达量与对照组相比是上升的,CLC-c1的表达量与对照组相比没有发生显著变化;400mM NaCl处理条件下,CLC-b的表达量与对照组相比是下降的;CLC-c1和CLC-c2的表达量与对照组相比是上升的。在0.5 mM NO3-水平上,200 mM NaCl条件下盐地碱蓬叶片中NR-1和NR-2的表达量与对照组相比是上升的,NR-3的表达量下降,400mM NaCl条件下,NR-1的表达量与对照组相比是下降的,NR-2和NR-3的表达量与对照组相比是上升的。与对照相比,200mM NaCl处理的盐地碱蓬叶片中NO3-含量以及NR活性升高,400 mM NaCl处理时降低。NO3-含量和NR活性结合荧光定量PCR的结果说明CLC-b与NR-1的基因表达的趋势与生理指标的测定结果是一致的,这两个基因可能与盐地碱蓬 NO3-累积和还原相关的基因。本文重点对可能与NO3-积累相关的CLC-b进行了研究(暂时命名为SsCLC-1)进行了克隆。200 mM NaCl并没有降低盐地碱蓬叶片中的叶绿素、游离氨基酸和可溶性蛋白的含量。400 mM NaCl条件下叶绿素含量降低,游离氨基酸和可溶性蛋白的含量增加。结合基因的表达结果和生理指标的测定结果,说明了盐地碱蓬在低氮生境中叶片能够积累较多的 NO3-,以便在外界硝态氮缺乏时利用自身储存的 NO3-来维持正常的氮代谢,这可能是盐地碱蓬能在高盐低氮环境中正常生长的重要机制之一。⑵根据转录组测序得到的基因片段,通过 NCBI进行 Blast,得到与其它物种相似度较大的中间片段,设计引物得到SsCLC-1基因的中间片段。再通过5 RACE和3 RACE技术克隆得到5片段和3片段,拼接全长后设计两端特异引物进行全长克隆。该基因编码区共有2427 bp,编码808个氨基酸,蛋白质相对的分子质量约为8.9 kDa、理论等电点 pI为8.38,总共包括12717个原子,分子式为C4056H6429N1053O1144S35。蛋白质的一级结构分析表明,该基因编码强酸性氨基酸73个,强碱性氨基酸78个;疏水氨基酸326个,极性氨基酸147个;该蛋白的不稳定指数为34.3,脂肪指数为106.78,该蛋白为稳定蛋白。亲水性和疏水性分析表明该蛋白为疏水性蛋白。蛋白二级结构组分中,无规则卷曲(C)占43.81%,α-螺旋(H)占33.42%,β-折叠(E)占22.77%。经过同源序列比对后发现,该基因与高碱蓬(Suaeda altissima) CLC-1基因同源性最高,同源性为95%;与甜菜(Beta vulgaris)和胡杨(Populus euphratica)的CLC-b和CLC-a的同源性分别为87%和81%,表明盐地碱蓬氯离子通道蛋白 SsCLC-1基因与高碱蓬、甜菜、胡杨等亲缘关系较近。SsCLC-1的功能有待进一步验证。