论文部分内容阅读
硒作为人体微量元素,在抗氧化、抗应激、提高免疫力和防治癌症等方面起着重要的作用,但无机硒的毒性大且利用率低。与无机硒相比,有机硒具有更高的吸收率、生物活性强、毒性低等特点。富硒云芝糖肽是云芝糖肽与硒形成的有机硒复合物,利用云芝生物转化作用将无机硒亚硒酸钠转化为有机硒,进而形成富硒云芝糖肽,以进一步增强云芝糖肽的抗肿瘤功效,降低放化疗毒副反应。首先,采用石墨炉原子吸收光谱法检测富硒云芝糖肽中的硒含量,通过探究微波消解条件:消解试剂的种类和用量,微波消解温度和时间,以及原子吸收光谱法中的基体改进剂、灰化温度、原子化温度进行了优化,进行了精确性、准确度、线性、范围等方法学研究,建立了石墨炉原子吸收法测定富硒云芝糖肽中硒含量的方法:选用硝酸:过氧化氢(5:1)作为消解试剂,硝酸使用量为3ml,过氧化氢使用量为0.6ml,微波消解温度为180℃,酸解3小时;选用硝酸钯作为基体改进剂,灰化温度1200℃,原子化温度1900℃。通过代料栽培云芝获得云芝子实体,分离云芝单孢子,进行PDA平板复壮培养获得云芝菌株;利用2%溶壁酶于32℃水浴振荡酶解云芝菌丝体3h制备云芝原生质体,再通过0s、30s、60s、90s、120s和150s的紫外照射诱变和再生培养获得云芝突变株。通过分离获得150株突变菌株,在含有80μg/ml亚硒酸钠的PDA平板于26℃培养箱中进行初筛培养,根据菌株硒的耐受率,筛选出耐硒能力较强的三株诱变云芝菌株5.9-30-1、6.26-30-4、9.20-60-5;最后在26℃条件下,进行深层液体富硒发酵72h,通过复筛比较诱变菌株的菌丝体得率,云芝糖肽收率,硒含量,获得具有较强耐硒能力的富硒诱变云芝菌株5.9-30-1:菌株5.9-30-1硒耐受率为2.20%,菌丝体得率为11.45g/l,菌丝体硒含量为469mg/kg,云芝糖肽得率为1.26g/l,云芝糖肽硒含量为401.6mg/kg。本文考察了富硒云芝糖肽的提取工艺,按照水提醇沉法提取富硒云芝糖肽,通过考察水料比、提取温度、提取时间优选得到了富硒云芝糖肽的提取工艺条件:提取时间4h,水料比30:1,提取温度95℃。实验探究验证了摇瓶富硒发酵的单因素条件,确定了接种量、装液量、亚硒酸钠浓度三个关键因素,利用Design-Expert.8软件进行了三因素三水平响应面实验对发酵液工艺中接种量、温度和转速进行条件优化实验的设计,得到富硒云芝糖肽的最佳生产工艺:接种量为11.18%,装液量为9.39%,亚硒酸钠添加量30μg/ml时,富硒云芝糖肽中硒含量259.3mg/kg。与优化预测值相比,其相对误差在10%左右。