1研究目的:　　 本课题以银黄方为研究对象,利用膜分离技术按分子量大小将银黄方水煎液分成各级膜分离物。通过化学方法和仪器分析方法,对各级膜分离物中化学成分定性、定量研究。各级膜分离物与药典方法制备的银黄口服液进行比较,论述膜分离方法对于银黄方有效成分分离、富集的科学性及可行性。结合各级膜分离物的抗炎实验结果,观察银黄方膜分离物的抗炎作用,初步了解银黄方膜分离物的药效物质基础。　　 2研究方法:　　 2.1膜分离系统选择　　 采用HPLC法测定银黄方膜分离物中黄芩苷和绿原酸的含量,以得率和转移率为检测指标,筛选出高效的膜分离组合系统。　　 2.2银黄方膜分离物共有峰的鉴定　　 应用HPLC法建立银黄口服液及银黄方膜分离物的全成分指纹图谱,通过比对各样品的指纹图谱,找出共有特征峰。　　 2.3银黄方膜分离物中化学成分归属鉴定　　 利用HPLC-MS／MS联用技术,对银黄方膜分离物采用HPLC分离后电喷雾质谱在线检测的方法,鉴定膜分离物中各组分归属。　　 2.4两种制备工艺银黄方中有效成分的定量研究　　 2.4.1利用梯度洗脱HPLC同时测定银黄口服液、银黄方水煎液及各级膜分离物中黄芩苷、汉黄芩苷、绿原酸含量。　　 2.4.2采用苯酚-硫酸法,应用紫外分光光度计测定银黄口服液、银黄方水煎液及各级膜分离物中多糖含量。　　 2.4.3应用原子吸收分光光度法,测定银黄口服液、银黄方水煎液及各级膜分离物中微量元素含量。　　 2.5银黄方膜分离物的抗炎作用分析　　 以角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀模型为研究对象,容积法测定足肿胀度,硝酸还原酶法测定组织液和血清中NO含量,考察银黄方膜分离物抗炎作用。　　 3研究结果:　　 3.1膜分离系统选择　　 对两种膜组合的转移率(膜间及水煎液)和药材得率进行考察。第四级膜时,组合1(5000分子量)使30％左右的黄芩苷和50％以上的绿原酸被截留,转移率较低；组合2(2万分子量)对黄芩苷和绿原酸的转移率均可达90％以上。组合1的黄芩苷和绿原酸相对于水煎液转移率分别为49.4％和26.2％,相对于药材得率分别为9.2％和2.4％；组合2的黄芩苷和绿原酸相对于水煎液转移率分别为103.6％和100.5％,相对于药材得率分别为14.3％和4.3％。连续三批银黄方水煎液膜分离效率稳定性验证结果:各级膜之间转移率稳定且高于70％,黄芩苷和绿原酸相对于水煎液转移率均高于50％,分离效率高。　　 3.2银黄方膜分离物共有峰的鉴定　　 样品银黄口服液、银黄方水煎液及一至五级膜分离物的指纹图谱经共有峰分析,确定了银黄方水煎液及一至五级膜分离物中存在9个共有峰,银黄口服液中存在其中4个色谱峰,分别为一号峰(绿原酸)、五号峰(黄芩苷)、八号峰(未知物)、九号峰(汉黄芩苷),缺少其余五个色谱峰。　　 3.3银黄方膜分离物中化学成分归属鉴定　　 黄芩水煎液、金银花水煎液、银黄方水煎液、银黄口服液、银黄方第五级膜分离物的HPLC图谱纵向叠加得出:金银花和黄芩共煮过程中未发现有新成分出现及成分消失,指认9个色谱峰中1、2、3、4号峰来自金银花药材,其余来自黄芩药材。鉴定了银黄方膜分离物中5个已知化合物分别为绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素。比对文献推断了4个化合物可能的结构,分别为绿原酸同分异构体、两个异绿原酸同分异构体、千层纸甲苷。　　 3.4两种制备工艺银黄方中有效成分的定量研究　　 3.4.1黄芩苷、绿原酸、汉黄芩苷测定结果:银黄方第五级膜分离物中黄芩苷、绿原酸、汉黄芩苷得率(6.50％)高于药典工艺制备的银黄方(3.67％)。以黄芩苷、绿原酸相对于饮片中有效成分的转移率和成品量为指标,得出银黄方第五级膜分离物的黄芩苷、绿原酸转移率(49.89％,80.20％)和成品量(2.91mL·g-1生药,14.04mL·g-1生药)均高于药典工艺制备的银黄方的黄芩苷、绿原酸转移率(28.28％,63.76％)和成品量(1.65mL·g-1生药,11.16mL·g-1生药)。　　 3.4.2多糖测定结果:银黄方第五级膜分离物中多糖质量(1.06g)最低,银黄方水煎液中多糖质量(163.48g)最高,各级膜分离物中多糖质量均不等。　　 3.4.3微量元素测定结果:共测定了13种元素包括铜、锌、锰、铁、铬、镉、铅、钙、锶、镍、钴、钠、钡,银黄方水煎液中检测到8种分别为铜、锌、铁、锰、钙、锶、镍、钡,第一、五级膜分离物和银黄口服液中4种元素分别为锌、铁、锰、钙,第二、三、四级膜分离物中3种元素分别为锌、铁、钙。检测到微量元素总质量由高至低排序为银黄方水煎液(2.89)>第五级膜分离物(0.99)>银黄口服液(0.41)>第一级膜分离物(0.24)>第四级膜分离物(0.15)>第三级膜分离物(0.11)=第二级膜分离物(0.11)。　　 3.5银黄方膜分离物的抗炎作用分析　　 银黄方膜分离物对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的抗炎作用结果:由足肿胀度结果可知,地塞米松组、银黄方第三级、五级膜分离物组均有抗炎作用。与模型组比较,地塞米松组在致炎后4、5h表现出抗炎作用差异显著(P<0.05),银黄方第三级、第五级膜分离物分别在致炎后1、2h和1、2、6h表现出抗炎作用差异非常显著(P<0.01)。由血液及组织液中NO含量可知,除银黄方第二级膜分离物外,其余各组均有抗炎作用。与模型组比较,第一级膜分离物抗炎作用表现出显著差异(P<0.05),其余各组抗炎作用均表现出非常显著差异(P<0.01)。　　 4结论:　　 4.1膜分离系统选择　　 黄芩苷、绿原酸的转移率(膜间及水煎液)和药材得率三个指标,从不同角度考察了两种组合膜分离系统分离效率,证明组合2膜分离系统分离效率优于组合1。连续三批银黄方水煎液膜分离,验证了组合2膜分离系统用于本研究的可行性及稳定性。故选择组合2的膜分离系统进行本课题的研究。　　 4.2银黄方膜分离物共有峰的鉴定　　 由HPLC图谱分析,确定了银黄方水煎液及一至五级膜分离物中存在9个共有峰,银黄口服液中存在其中4个色谱峰。说明膜分离方法可以保留组方更多原有化学成分,比药典方法制备的银黄口服液中化学成分种类和数量多。　　 4.3银黄方膜分离物中化学成分归属鉴定　　 银黄方膜分离物中化学成分经HPLC-MS／MS分析,鉴定了银黄方膜分离物中5种化合物的归属,推断了4种化合物的可能结构。与黄芩、金银花药材比较,发现银黄方膜分离物中化学成分种类没有损失。银黄口服液与银黄方膜分离物比较,缺少其中8、9号峰,即黄芩素和汉黄芩素。说明银黄方膜分离物保留了组方更多原有化学成分种类。　　 4.4两种制备工艺银黄方中有效成分的定量研究　　 4.4.1黄芩苷、绿原酸、汉黄芩苷的含量测定:银黄方第五级膜分离物中黄芩苷、绿原酸、汉黄芩苷相对于药材得率高于药典工艺制备的银黄方。其黄芩苷、绿原酸转移率和成品量均高于药典工艺制备的银黄方。充分证明了膜分离工艺应用于中药复方有效成分或有效部位的分离、富集的可行性。　　 4.4.2多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、促进免疫等方面都发挥着重要生物活性。因此对多糖的测定有着重要的意义[1]。本实验测定各级膜分离物多糖质量和低于水煎液中质量,可能为水煎液中部分多糖被截留在膜分离系统所致。多糖通过膜分离系统,每级膜截留得到多糖质量不等,说明多级膜分离系统也能按分子量将不同分子量段多糖分段分离。　　 4.4.3由各样品中微量元素质量和排序可知,银黄方水煎液及第五级膜分离物中微量元素质量和均高于银黄口服液,说明传统合煎的方法以及合煎后膜分离方法比药典方法更有利于保证原有微量元素含量。且膜分离方法对于微量元素同样起到了分离、富集的作用。　　 4.5银黄方膜分离物的抗炎作用分析　　 应用角叉菜胶致大鼠足肿胀模型,观察银黄方膜分离物的早期抗炎作用。以足肿胀度、血清和组织液中NO含量为评价指标,得出银黄方膜分离物具有抗早期炎症作用,且第五级膜分离物抗炎作用最明显,第三和第四级膜分离物抗炎作用与模型组比较也有显著差异,推测是因为第三和第四级膜分离物中黄芩苷、绿原酸、汉黄芩苷、多糖、微量元素相对于干膏含量高(71.7％,98.4％),银黄方第三、四级膜分离物得干膏重量较低,可将三、四、五级膜分离物合并为终产物。与第五级膜分离物比较,上述成分相对于干膏含量可提高6.6个百分点,相对于药材得率提高3.3个百分点,相对于水煎液转移率提高13.2个百分点。　　 4.6综上所述,可知从化学角度和药效学角度均证明了膜分离技术应用于中药复方有效成分或有效部位分离、富集的可行性及科学性。